C. 예인대 이동 추적: 웜의 운동 을 평가하는 방법

Overview

이 비디오는 비디오에서 웜 움직임을 기록하기 위해 비디오 및 추적 소프트웨어를 사용하여 설명합니다.  예제 프로토콜은 웜 운동에 에탄올 노출의 효과를 측정합니다.

Protocol

다음 프로토콜은 데이비스 외에서 발췌, Caenorhabditis elegans의운동 속도에 에탄올의 효과를 측정하기위한 분석, J. Vis. Exp. (2015). 

1. 분석 전날 에 수행할 단계

   1. Op50 E. 대장균의잔디로 시드된 신선한 선충 성장 매체(NGM) 플레이트에 L4 단계 웜을 선택하고 20°C O/N으로 배양한다. 각 분석 조건은 10개의 벌레를 요구합니다; 웜의 O/N 손실을 허용하기 위해 웜의 과잉을 선택합니다.
      1. 단지 첫날 성인 인 동물을 분석; 많은 돌연변이는 야생 유형보다 느린 속도로 자랍니다. 테스트된 모든 동물이 첫날 성인이 되도록 발달 지연이 있는 균주에 대한 따기 타이밍을 조정합니다.
2. 분석의 날에 수행 하는 단계
   1. 분석 준비:
      1. 표준 시드 되지 않은 60 x 15 mm NGM 플레이트에 대 한 에세이를 수행 합니다. 뚜껑을 끄고 37°C에서 2시간 동안 사용할 모든 플레이트를 건조시다. 각 실험 시험에 대해, 4개의 말린 NGM 플레이트를 사용하십시오; 이들은 0 mM 및 400 mM 에탄올 분석 플레이트와 함께 제공되는 적응 판이 될 것입니다.
         참고: NGM 플레이트의 사용은 여기에서 중요합니다. 플레이트의 조성물, 특히 그들의 발진성, 행동에 에탄올의 용량 반응에 강하게 영향을 미칠 수 있으며, 이는 적어도 부분적으로는 동물에 의해 축적된 에탄올의 양 변화에 기인한다. NGM 한천은 160mOsm입니다.
      2. 건조 후, 분석에서 사용되는 시드되지 않은 NGM 플레이트의 각 무게를 측정하고 무게를 주의한다. 빈 플레이트의 무게에 따라 플레이트의 용지 량을 결정합니다. 한고의 중량을 볼륨으로 변환하는 것과 근사하려면 미디어가 동일한 양의 물과 동일한 무게라고 가정합니다.
         참고: 우리의 가장 일관된 결과는 원래 10ml 부피가 8.3-8.9 ml 사이의 건조 후 부피를 가지고 충분히 탈수 한 NGM 미디어와 함께 발견되었습니다. 2 시간 건조 시간에 대한 대안은 플레이트가 인큐베이터의 차이를 설명하기 위해이 볼륨 범위에 도달 할 때까지 건조하는 것입니다.
      3. 4 개의 구리 고리 (1.6cm의 내경)를 각 플레이트의 표면에 녹여 다른 유전자형 또는 웜의 치료 그룹에 대한 산호 역할을합니다. 각 링을 집게로 잡고 화염에 열을 가합니다(분젠 버너의 강한 불꽃이 잘 작동함)은 약 3초 동안 가열합니다. 즉시 링에 놓고 링에 집게를 들고 '건너뛰기'를 방지합니다.
         1. 링의 여러 지점에서 집게로 부드럽게 눌러 링이 한고 표면에 평평하게 놓여 있는지 확인합니다. 링을 배치할 때 는 3개의 링을 추가로 수용할 수 있는 공간을 두십시오.
         2. 세 개의 구리 고리를 플레이트 표면에 녹여 서 가능한 한 가깝게 배치하여 네 개의 구리 가 모두 카메라 의 시야에 있게 됩니다.
            참고: 분석 중에 벌레를 고리에 보관하려면 한천으로 좋은 밀봉을 만드는 것이 필수적입니다. 접시에서 건너뛰는 링은 한천으로 올바른 씰을 만들 가능성이 낮으며 한천을 흉터가 생길 수 있으므로 벌레가 잠복하고 벌레를 시각화하는 데 방해가 됩니다.
         3. 각 분석판에 대해 건조하고 씨를 뿌리지 않아야 하며 에탄올이 없는 "적응" 플레이트를 준비합니다. 이 접시에 구리 반지 4개를 놓습니다.
      4. 각 링 옆에 있는 플레이트의 바닥에 웜 스트레인을 링에 사용할 수 있는 레이블을 지정하여 링 자체의 시야에 쓰지 않도록 주의하십시오. 첨부 된 적응판과 분석 플레이트의 라벨을 일치시.
      5. 최종 농도가 0mM 또는 400mM 에탄올(중량에 무게)이 되도록 각 분석판에 첨가하는 100% 에탄올의 양을 계산한다. 각 실험(n=1)에 대해 0mMM 1과 400mMMMMM 플레이트가 있을 것이다. 적응 판은 에탄올을 받지 않습니다. 에탄올을 추가하여 플레이트 표면 주위에 파이펫을 넣습니다. 실험실 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 벤치 탑에서 2 시간 동안 평형화 할 수 있습니다.
      6. 1.5시간 경과하면 분석, 2.2단계의 적응 단계를 시작합니다.
   2. 운동 분석 수행: 분석 플레이트
      1. 각 실험군의 10개의 벌레를 적응판의 구리 고리 중심으로 조심스럽게 이송한다. 벌레 선택으로 부드럽게 긁어이 시점에서 한천에 보이는 음식을 제거합니다. 실험 단이 실험 시험을 통해 접시에 놓이는 순서를 다양화하여 동일한 균주가 시험 전반에 걸쳐 동일한 순서로 플레이트에 놓이지 않도록 합니다.
         참고: 목표는 체표판에 음식이 분석 판으로 옮겨지면 벌레가 음식 주위를 집계하고 약이 운동에 미치는 영향이 가려지기 때문에 최소한의 양의 음식으로 동물을 접시로 옮기는 것입니다.
      2. 이 벌레가 잠복 할 수 있도록하고 분석이 중단됩니다으로, 선택과 함께 한고의 표면을 깰하지 않도록주의하십시오. 30 분 동안 RT에서 웜을 배양.
      3. 각 플레이트의 개시 사이에 적절한 간격이 있는지 확인합니다. 숙련된 실험자는 40마리의 동물, 10/링 4개의 링을 1.5분 동안 이동할 수 있지만, 최대 2분 간격은 허용됩니다. 표준 분석에는 0mM과 400 mM 에탄올 모두에 대해 10-12 분 및 30-32 분 의 노출로 녹화 된 영화가 있습니다.
      4. 0mM 노출 및 400 mM 노출에 대한 적응판을 시작하여 두 번째 영화가 시작되기 전에 첫 번째 영화 파일을 저장할 수 있도록 약 2 분 및 30 초 간격으로.
      5. 30분 적응 기간 이후에 는 적응판에서 분석 판으로 웜을 옮길 수 있습니다. 웜을 분석 플레이트(0mM 또는 400mMM 에탄올)로 전송하여 적응판에 첨가하여 각 플레이트의 완성 사이의 타이밍을 추적한다. 기화에 에탄올의 손실을 최소화하기 위해 실험실 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오.
      6. 평평한 픽 위에 웜을 수집하기 위해 얇은 가장자리의 평평한 웜 픽으로 스쿱 모션을 사용합니다. 시드되지 않은 적응판에서 분석 플레이트로 웜을 옮기는 것을 수행하여 박테리아를 사용하지 않고 벌레를 픽에 붙이는 데 도움이 되기 때문에 벌레를 옮기는 데 일반적으로 사용됩니다.
         참고: 플레이트의 첫 번째 웜이 접시에 추가된 마지막 벌레보다 더 오래 에탄올에 노출되고, 이전 시간 지점이 몇 가지 시간 의존효과를 나타낼 수 있기 때문에 이 단계에서 동물이 이송되는 속도는 매우 중요합니다. 이것은 실험 복제를 통해 먼저 접시에 배치되는 균주를 회전시키는 주요 이유입니다.
   3. 운동 분석 수행: 촬영
      1. 0.5배 현미경 목표, 0.8배 배율 및 2048x2048 7.4 μm 픽셀 CCD를 갖춘 카메라와 같이 시야내 4개의 고리(약 42x42 mm² 평방)의 동시 이미징을 허용하는 현미경/카메라 조합을 사용합니다.
      2. 강도 임계값 단계에서 개체 인식을 돕는 시야 전체에서 조명도 사용합니다. 3"x3"백라이트가 잘 작동합니다.
      3. 플레이트위치 미디어 측(뚜껑 아래)의 웜을 이미지화하여 기존의 현미경 전송 광원에 비해 백라이트를 사용할 때 손실되는 콘트라스트를 생성합니다.
      4. 움직이는 웜의 시간 경과 동영상을 캡처하려면 이미지 분석 소프트웨어를 준비합니다. 2분(120프레임) 동영상으로 1초마다 12비트 회색 크기 이미지를 캡처하도록 소프트웨어를 설정합니다. 출력 파일의 크기를 줄이려면 충분한 이미지 해상도를 유지하면서 2x2 binning 모드를 사용하여 1024x1024 픽셀 이미지를 캡처합니다.
      5. 영화를 녹화합니다. 마지막 벌레가 그 접시에 놓인 후 10분 후에 첫 번째 플레이트(0mM ethanol)의 120프레임 영상 녹화를 시작합니다. 동영상 파일을 저장합니다.
      6. 두 번째 플레이트(400mM 에탄올)를 기록합니다. 마지막 웜이 첫 번째 플레이트(0 mM Ethanol)에 배치된 후 30분부터 시작되는 두 플레이트에 대해 이 과정을 반복하여 각 노출에 대해 30~32분 시간 점을 캡처합니다.
         참고: 분석할 다음 플레이트의 녹화를 시작하기 전에 각 캡처 세션 후에 이미지 파일을 저장하는 데 충분한 시간을 할애합니다.
      7. 보관된 영화의 미래 방지를 위해 ImageJ와 같은 다른 공용 도메인 오픈 소스 이미징 소프트웨어 프로그램에서 이러한 영화를 열고 분석할 수 있도록 각 영화의 복사본을 8비트 256 회색 스케일 TIFF 파일로 변환합니다.
         참고: 여기에 설명된 이미지 분석 소프트웨어는 독점 파일 형식을 사용합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.