C. elegans Bevegelsessporing: En metode for å vurdere bevegelse i ormer

Overview

Denne videoen beskriver bruken av video- og sporingsprogramvare for å registrere ormbevegelser på en arena.  Eksempelprotokollen måler effekten av etanoleksponering på orm-bevegelse.

Protocol

Følgende protokoll er et utdrag fra Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Fremgangsmåte for å utføre dagen før analysen

   1. Velg L4-scene ormer til ferske nematode vekst medium (NGM) plater frøet med en plen av OP50 E. coli, og kultur dem ved 20 °C O/N. Hver analysebetingelse krever 10 ormer; Velg et overskudd av ormer for å tillate O/N-tap av ormer.
      1. Bare analysedyr som er førstedags voksne; mange mutanter vokser med lavere hastighet enn vill type. Juster tidspunktet for plukking for stammer som har utviklingsforsinkelser, slik at alle dyr som testes er førstedags voksne.
2. Trinn for å utføre på analysedagen
   1. Forberedelse til analysen:
      1. Utfør analyser på standard usette 60 x 15 mm NGM-plater. Tørk alle platene som skal brukes ved 37 °C i 2 timer, med lokkene av. For hver eksperimentelle studie, bruk fire tørkede NGM-plater; Disse vil være 0 mM og 400 mM etanol analyseplater og deres tilhørende akklimatiseringsplater.
         MERK: Bruk av NGM-plater er viktig her; forskjeller i sammensetningen av platene, spesielt deres osmolaritet, kan sterkt påvirke doseresponsen av etanol på oppførsel, dette skyldes i det minste delvis endringer i mengden etanol akkumulert av dyrene. NGM agar er 160 mOsm.
      2. Etter tørking, vei hver av de usette NGM-platene som skal brukes i analysen og noter vekten. Bestem medievolumet i platene basert på vekten av en tom plate. For å tilnærme konverteringen av agarens vekt til volum, anta at mediet veier det samme som et likt volum vann.
         MERK: Våre mest konsistente resultater er funnet med NGM-medier som har dehydrert tilstrekkelig til at et originalt volum på 10 ml har et ettertørkende volum mellom 8,3-8,9 ml. Et alternativ til 2 timers tørrtid er å tørke til platene når dette volumområdet for å ta hensyn til forskjeller i inkubatorer.
      3. Smelt 4 kobberringer (indre diameter på 1,6 cm) i overflaten av hver av platene for å fungere som korraler for de forskjellige genotypene eller behandlingsgruppene av ormer. Ta tak i hver ring med tang, og varm i en flamme (en sterk flamme fra en Bunsen-brenner fungerer bra) i ca. 3 sek. Plasser straks ringen på en tallerken mens du fortsatt holder ringen med tangene for å forhindre at den "hopper over".
         1. Pass på at ringen hviler flatt mot overflaten av agaren ved å trykke forsiktig ned med tangene på flere punkter på ringen. Når du plasserer ringen, må du passe på å gi plass til ytterligere tre ringer.
         2. Smelt de tre ekstra kobberringene inn i overflaten av platen, og pass på å plassere dem så nært sammen som mulig, slik at alle fire vil være i kameraets synsfelt.
            MERK: Å lage en god segl med agaren er viktig for å holde ormene i ringene under analysen. Ringer som hopper rundt på platen er usannsynlig å gjøre riktig segl med agaren og kan skremme agaren, noe som gjør at ormer kan grave og forstyrrer visualiseringen av ormene.
         3. For hver analyseplate lag en medfølgende "akklimatisering" plate, som skal tørkes og unseeded og vil ikke motta etanol. Legg fire kobberringer på disse platene.
      4. Merk bunnen av platene ved siden av hver ring med ormstammen som skal brukes i ringen, pass på at du ikke skriver i selve ringens synsfelt. Match etikettene på analyseplaten med den medfølgende akklimatiseringsplaten.
      5. Beregn mengden 100% etanol for å legge til hver analyseplate slik at den endelige konsentrasjonen er 0 mM eller 400 mM etanol (vekt til volum). For hvert eksperiment (n = 1) vil det være en 0 mM og en 400 mM etanolplate; akklimatiseringsplater mottar ikke etanol. Tilsett etanol, pipetter det rundt overflaten av platen. Bruk laboratoriefilm til å forsegle platen og la den likevekte på benken i 2 timer.
      6. Når det har gått 1,5 timer, begynner du akklimatiseringstrinnet i analysen, trinn 2.2.
   2. Utfør bevegelsesanalyse: Analyseplater
      1. Overfør forsiktig 10 ormer av hver eksperimentell gruppe til midten av en kobberring på akklimatiseringsplaten. Fjern all mat som er synlig på agaren på dette tidspunktet ved å skrape forsiktig med ormplukkingen. Varier rekkefølgen eksperimentgruppene legges i på platene på tvers av eksperimentelle forsøk, slik at de samme stammene ikke legges på platene i samme rekkefølge på tvers av forsøk.
         MERK: Målet er å overføre dyrene til tallerkenen med minimale mengder mat, fordi hvis mat på akklimatiseringsplaten overføres til analyseplaten, vil ormene samles rundt maten og effekten av stoffet på bevegelse vil bli skjult.
      2. Vær forsiktig så du ikke bryter overflaten av agaren med plukket, da dette vil tillate ormene å grave og forstyrre analysen. Inkuber ormene på RT i 30 min.
      3. Forsikre deg om at det er et passende intervall mellom initieringene av hver plate. En erfaren eksperimenter kan flytte 40 dyr, 10/ring i 4 ringer i < 1,5 min, men ethvert intervall på opptil 2 min er akseptabelt. Standardanalysen har filmer med opptak på 10-12 min og 30-32 min eksponering for både 0 mM og 400 mM etanol.
      4. Start akklimatiseringsplaten for 0 mM-eksponeringen og akklimatiseringsplaten for 400 mM-eksponeringen ca. 2 min og 30 sek fra hverandre for å tillate lagring av den første filmfilen før den andre filmen må begynne.
      5. Etter akklimatiseringsperioden på 30 minutter overfører du ormene fra akklimatiseringsplatene til analyseplatene. Overfør ormene til analyseplatene (0 mM eller 400 mM etanol) i samme rekkefølge som de ble lagt til akklimatiseringsplaten, og hold oversikt over timingen mellom ferdigstillelsene av hver plate. Forsegle platen med laboratoriefilm for å minimere tap av etanol til fordampning.
      6. Bruk en scooping bevegelse med en tynnkantet flatt orm plukke for å samle ormer på toppen av den flate plukke. Utfør overføringen av ormer fra den usette akklimatiseringsplaten til analyseplaten uten bruk av bakterier, som ofte brukes til å overføre ormer, da det bidrar til å lime ormen til plukkingen.
         MERK: Hastigheten som dyr overføres med på dette trinnet er svært viktig fordi de første ormene på platen vil bli utsatt for etanol lenger enn de siste ormene som er lagt til platen, og tidligere tidspunkter kan vise noen tidsavhengige effekter. Dette er hovedårsaken til at du roterer hvilke stammer som plasseres på en tallerken først over eksperimentelle replikeringer.
   3. Utfør bevegelsesanalyse: Filming
      1. Bruk en mikroskop/kamerakombinasjon som muliggjør samtidig bildebehandling av alle fire ringene i synsfeltet (ca. 42 x 42 mm² kvadrat), for eksempel et 0,5x mikroskopmål, 0,8x forstørrelse og et kamera med en CCD på 2048 x 2048 7,4 μm piksler.
      2. Bruk jevn belysning på tvers av synsfeltet, som hjelper til med objektgjenkjenning ved intensitetsterskeltrinnet. En 3"x3" bakgrunnsbelysning fungerer bra.
      3. Bilde ormene på en plate plassert media-side opp (lokk ned), som genererer kontrast som går tapt når du bruker bakgrunnsbelysningen sammenlignet med en tradisjonell mikroskop overført lyskilde.
      4. Forbered bildeanalyseprogramvaren for å fange opp tidsforløpfilmer av de bevegelige ormene. Angi at programvaren skal ta 12-biters gråtonebilder hvert 1. Hvis du vil redusere størrelsen på utdatafilen, samtidig som du beholder tilstrekkelig bildeoppløsning, bruker du en 2x2 binning-modus til å ta bilder på 1024 x 1024 piksler.
      5. Ta opp filmene. Begynn å spille inn en 120-ramme film av den første platen (0 mM etanol) 10 min etter at de siste ormene ble plassert på den platen. Lagre filmfilen.
      6. Registrer den andre platen (400 mM etanol). Gjenta denne prosessen for begge platene som begynner 30 minutter etter at de siste ormene ble plassert på den første platen (0 mM etanol) for å fange 30-32 min tidspunkter for hver eksponering.
         MERK: Gi tilstrekkelig tid til å lagre bildefilene etter hver opptaksøkt før du begynner innspillingen av neste plate som skal analyseres.
      7. For fremtidig korrektur av arkiverte filmer og for å tillate at disse filmene åpnes og analyseres av andre offentlige domene open source imaging-programmer, for eksempel ImageJ, konverterer du en kopi av hver film til 8-biters 256 gråskala TIFF-filer.
         MERK: Bildeanalyseprogramvaren som er beskrevet her, bruker et proprietært filformat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.