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Encyclopedia of Experiments

C. elegans Bewegungsverfolgung: Eine Methode zur Bewertung der Fortbewegung in Worms

Overview

Dieses Video beschreibt die Verwendung von Video- und Tracking-Software, um Wurmbewegungen in einer Arena aufzuzeichnen.  Das Beispielprotokoll misst die Auswirkungen der Ethanolexposition auf die Schneckenfortbewegung.

Protocol

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. (2015).

  1. Schritte, die am Tag vor dem Assay durchgeführt werden sollen

    1. L4-Bühnenwürmer auf frische Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platten mit einem Rasen von OP50 E. coliaussaiert und bei 20 °C O/N kulturieren. Jede Assay-Bedingung erfordert 10 Würmer; einen Überschuss an Würmern zu pflücken, um den O/N-Verlust von Würmern zu ermöglichen.
      1. Nur Assay-Tiere, die Erwachsene am ersten Tag sind; viele Mutanten wachsen langsamer als Wildtyp. Passen Sie den Zeitpunkt der Kommissionierung für Stämme an, die Entwicklungsverzögerungen haben, sodass alle getesteten Tiere Erwachsene am ersten Tag sind.
  2. Schritte, die am Tag des Assays durchgeführt werden sollen
    1. Vorbereitung auf den Test:
      1. Führen Sie Assays auf standardunsätten 60 x 15 mm NGM-Platten durch. Trocknen Sie alle Platten, die bei 37 °C für 2 Stunden verwendet werden, mit Deckeln aus. Verwenden Sie für jede Versuchsstudie vier getrocknete NGM-Platten; dabei handelt es sich um die 0 mM und 400 mM Ethanol-Assayplatten und die dazugehörigen Akklimatisierungsplatten.
        HINWEIS: Die Verwendung von NGM-Platten ist hier wichtig; Unterschiede in der Zusammensetzung der Platten, insbesondere ihre Osmolarität, können die Dosisreaktion von Ethanol auf das Verhalten stark beeinflussen, was zumindest teilweise auf Veränderungen der von den Tieren angesammelten Ethanolmenge zurückzuführen ist. NGM Agar ist 160 mOsm.
      2. Nach dem Trocknen wiegen Sie jede der nicht gesäten NGM-Platten, die im Test verwendet werden sollen, und notieren Sie das Gewicht. Bestimmen Sie das Medienvolumen in den Platten basierend auf dem Gewicht einer leeren Platte. Um die Umrechnung des Gewichts des Agars in volumen zu annähern, gehen Sie davon aus, dass das Medium das gleiche wie ein gleiches Wasservolumen wiegt.
        HINWEIS: Unsere konsistentesten Ergebnisse wurden bei NGM-Medien gefunden, die so dehydriert sind, dass ein ursprüngliches Volumen von 10 ml ein Nachtrocknungsvolumen zwischen 8,3 und 8,9 ml hat. Eine Alternative zur 2-stündigen Trockenzeit ist das Trocknen, bis die Platten diesen Volumenbereich erreichen, um Unterschiede in den Brutkästen zu berücksichtigen.
      3. Schmelzen Sie 4 Kupferringe (Innendurchmesser von 1,6 cm) in die Oberfläche jeder platte, um als Korral für die verschiedenen Genotypen oder Behandlungsgruppen von Würmern zu fungieren. Greifen Sie jeden Ring mit Zange, und Hitze in einer Flamme (eine starke Flamme aus einem Bunsenbrenner funktioniert gut) für etwa 3 Sek. Legen Sie den Ring sofort auf eine Platte, während Sie den Ring noch mit der Zange halten, um zu verhindern, dass er "springt".
        1. Stellen Sie sicher, dass der Ring flach an der Oberfläche des Agars ruht, indem Sie an mehreren Stellen des Rings sanft mit der Zange nach unten drücken. Achten Sie beim Platzieren des Rings darauf, Platz für weitere drei Ringe zu lassen.
        2. Schmelzen Sie die drei zusätzlichen Kupferringe in die Oberfläche der Platte und achten Sie darauf, sie so nah wie möglich beieinander zu platzieren, so dass alle vier im Sichtfeld der Kamera sind.
          HINWEIS: Eine gute Versiegelung mit dem Agar ist wichtig, um die Würmer in den Ringen während des Assays zu halten. Ringe, die auf der Platte herumspringen, sind unwahrscheinlich, dass sie die richtige Versiegelung mit dem Agar machen und kann den Agar vernarben, was Würmern erlaubt, sich zu vergraben und die Würmer visualisieren kann.
        3. Für jede Assayplatte eine begleitende "Akklimatisierungsplatte" vorbereiten, die getrocknet und ungesaiert werden sollte und kein Ethanol erhält. Legen Sie vier Kupferringe auf diese Platten.
      4. Beschriften Sie den Boden der Platten neben jedem Ring mit der Imring zu verwendenden Schneckenstämme, wobei Sie darauf achten, nicht in das Sichtfeld des Rings selbst zu schreiben. Passen Sie die Etiketten auf der Assayplatte mit der dazugehörigen Akklimatisierungsplatte an.
      5. Berechnen Sie die Menge von 100% Ethanol, die jeder Testplatte hinzugefügt werden soll, so dass die Endkonzentration 0 mM oder 400 mM Ethanol (Gewicht zu Volumen) beträgt. Für jedes Experiment (n = 1) gibt es eine 0 mM und eine 400 mM Ethanolplatte; Akklimatisierungsplatten erhalten kein Ethanol. Fügen Sie das Ethanol hinzu und pfeifen Sie es um die Oberfläche der Platte. Verwenden Sie Laborfolie, um die Platte zu versiegeln und lassen Sie es auf der Bank oben für 2 Stunden ausdematrieren.
      6. Wenn 1,5 Stunden verstrichen sind, beginnen Sie den Akklimatisierungsschritt des Assays, Schritt 2.2.
    2. Durchführung von Fortbewegungs-Assay: Assay-Platten
      1. Übertragen Sie vorsichtig 10 Würmer jeder Versuchsgruppe in die Mitte eines Kupferrings auf der Akklimatisierungsplatte. Entfernen Sie alle Lebensmittel, die an dieser Stelle auf dem Agar sichtbar sind, indem Sie vorsichtig mit dem Wurmpick kratzen. Variieren Sie die Reihenfolge, in der die versuchsweise Versuchsgruppen auf die Platten gelegt werden, damit die gleichen Stämme nicht in der gleichen Reihenfolge über Versuche hinweg auf die Platten gelegt werden.
        HINWEIS: Das Ziel ist es, die Tiere mit minimalen Mengen an Nahrung auf den Teller zu bringen, denn wenn Nahrung auf der Akklimatisierungsplatte auf die Assayplatte übertragen wird, werden die Würmer um das Futter aggregiert und die Wirkung des Medikaments auf die Fortbewegung wird verschleiert.
      2. Achten Sie darauf, nicht die Oberfläche des Agars mit der Pick zu brechen, da dies die Würmer graben und den Assay stören kann. Inkubieren Sie die Würmer bei RT für 30 min.
      3. Stellen Sie sicher, dass zwischen den Initiierungen der einzelnen Platten ein angemessenes Intervall besteht. Ein erfahrener Experimentator kann 40 Tiere bewegen, 10/Ring für 4 Ringe in < 1,5 min, aber jedes Intervall bis zu 2 min ist akzeptabel. Der Standard-Assay hat Filme Aufnahme bei 10-12 min und 30-32 min Exposition für 0 mM und 400 mM Ethanol.
      4. Initiieren Sie die Akklimatisierungsplatte für die 0 mM Belichtung und die Akklimatisierungsplatte für die 400 mM Belichtung ca. 2 min und 30 Sec auseinander, um die erste Filmdatei zu speichern, bevor der zweite Film beginnen muss.
      5. Nach der 30-min-Akklimatisierungszeit die Würmer von den Akklimatisierungsplatten auf die Assayplatten übertragen. Übertragen Sie die Würmer in der gleichen Reihenfolge auf die Assayplatten (0 mM oder 400 mM Ethanol), in der sie der Akklimatisierungsplatte hinzugefügt wurden, wobei der Zeitpunkt zwischen den Vervollständigungen der einzelnen Platten verfolgt wird. Versiegeln Sie die Platte mit Laborfolie, um den Ethanolverlust bis zur Verdampfung zu minimieren.
      6. Verwenden Sie eine Schaufelbewegung mit einem dünnkantigen abgeflachten Wurmpick, um Würmer auf der Oberseite des abgeflachten Picks zu sammeln. Führen Sie den Transfer von Würmern von der ungesättigten Akklimatisierungsplatte auf die Assayplatte ohne den Einsatz von Bakterien durch, die häufig bei der Übertragung von Würmern verwendet wird, da es hilft, den Wurm an die Kommissionzuklücke zu kleben.
        HINWEIS: Die Geschwindigkeit, mit der Tiere in diesem Schritt übertragen werden, ist sehr wichtig, da die ersten Würmer auf der Platte länger Ethanol ausgesetzt werden als die letzten Würmer, die der Platte zugesetzt wurden, und frühere Zeitpunkte können einige zeitabhängige Effekte zeigen. Dies ist der Hauptgrund für die Drehung, welche Stämme zuerst über experimentelle Replikationen auf eine Platte gelegt werden.
    3. Perform Locomotion Assay: Dreharbeiten
      1. Verwenden Sie eine Mikroskop-Kamera-Kombination, die eine gleichzeitige Abbildung aller vier Ringe im Sichtfeld (ca. 42x42 mm2 Quadrat) ermöglicht, wie z. B. ein 0,5-faches Mikroskopobjektiv, eine 0,8-fache Vergrößerung und eine Kamera mit einem 2048x2048 7,4-mm-Pixel-CCD.
      2. Verwenden Sie gleichmäßige Beleuchtung im gesamten Sichtfeld, was bei der Objekterkennung beim Intensitätsschwellenschritt hilft. Eine 3 "x 3" Hintergrundbeleuchtung funktioniert gut.
      3. Stellen Sie die Würmer auf einer platte positionierten Medienseite nach oben (Deckel nach unten), die Kontrast erzeugt, der bei Verwendung der Hintergrundbeleuchtung im Vergleich zu einer herkömmlichen Mikroskop-Durchlichtquelle verloren geht.
      4. Bereiten Sie die Bildanalysesoftware vor, um Zeitrafferfilme der sich bewegenden Würmer zu erfassen. Stellen Sie die Software so ein, dass sie alle 1 Sek. 12-Bit-Graustufenbilder als 2-Min(120-Frame)-Film aufnimmt. Um die Größe der Ausgabedatei zu reduzieren und dabei dennoch eine ausreichende Bildauflösung beizubehalten, verwenden Sie einen 2x2-Binning-Modus, um 1024x1024-Pixelbilder zu erfassen.
      5. Nehmen Sie die Filme auf. Beginnen Sie mit der Aufnahme eines 120-Frame-Films der ersten Platte (0 mM Ethanol) 10 min, nachdem die letzten Würmer auf dieser Platte platziert wurden. Speichern Sie die Filmdatei.
      6. Nehmen Sie die zweite Platte (400 mM Ethanol) auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang für beide Platten, beginnend 30 min, nachdem die letzten Würmer auf der ersten Platte (0 mM Ethanol) platziert wurden, um die 30–32 min Zeitpunkte für jede Belichtung zu erfassen.
        HINWEIS: Nehmen Sie sich genügend Zeit, um die Bilddateien nach jeder Aufnahmesitzung zu speichern, bevor Sie mit der Aufzeichnung der nächsten zu analysierenden Platte beginnen.
      7. Für die Zukunftssicherheit von archivierten Filmen und damit diese Filme von anderen Open-Source-Open-Source-Imaging-Softwareprogrammen wie ImageJ geöffnet und analysiert werden können, konvertieren Sie eine Kopie jedes Films in 8-Bit-TIFF-Dateien im Graustufengrau.
        HINWEIS: Die hier beschriebene Bildanalysesoftware verwendet ein proprietäres Dateiformat.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans strains Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented Greiner Bio-One 628161 Other plate brands will suffice.
NGM agar Various NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps Various e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator Various For drying agar
Copper rings Plumbmaster STK#35583 (48 cap thread gasket) 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol Various
Parafilm M Bemis PM996
CCD camera QImaging RET-4000R-F-M-12 This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective Leica MZ6 Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source Schott A08923 3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software Media Cybernetics ImagePro-Plus v6.0-6.3 Newer versions of the software have tracking functions.

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