C. Elegans Bevægelsessporing: En metode til vurdering af bevægelse i orme

Overview

I denne video beskrives brugen af video- og sporingssoftware til at optage ormebevægelser i en arena.  Eksempelprotokollen måler virkningen af ethanoleksponering på orme bevægelse.

Protocol

Følgende protokol er et uddrag fra Davies et al,An Assay for Måling af virkningerne af ethanol på Locomotion Speed af Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Trin til at udføre på dagen før Assay

   1. L4-stadieorme vælges til friske nematodevækstplader (NGM), der er seedet med en græsplæne på OP50 E. coli, og de dyrkes ved 20 °C O/N. Hver analysetilstand kræver 10 orme. vælge et overskud af orme for at give mulighed for O / N tab af orme.
      1. Kun assay dyr, der er første dag voksne; mange mutanter vokser med en langsommere hastighed end vilde type. Juster tidspunktet for plukning for stammer, der har udviklingsforsinkelser, så alle testede dyr er førstedags voksne.
2. Trin til at udføre på assaydagen
   1. Forberedelse til analysen:
      1. Udfør assays på standard useedede 60 x 15 mm NGM plader. Alle plader, der skal anvendes ved 37 °C i 2 timer, tørres af med lågene af. For hvert forsøg skal der anvendes fire tørrede NGM-plader. disse vil være 0 mM og 400 mM ethanol assay plader og deres ledsagende akklimatisering plader.
         BEMÆRK: Brugen af NGM-plader er vigtig her; forskelle i pladernes sammensætning, især deres osmolaritet, kan stærkt påvirke ethanolens dosisrespons på adfærd, dette skyldes i det mindste delvis ændringer i mængden af ethanol akkumuleret af dyrene. NGM agar er 160 mio.
      2. Efter tørring afvejes hver af de useedede NGM-plader, der skal anvendes i analysen, og vægten noteres. Bestem mediemængden i pladerne baseret på vægten af en tom plade. For at tilnærme agarens vægt til volumen antages det, at mediet vejer det samme som en lige stor mængde vand.
         BEMÆRK: Vores mest konsistente resultater er fundet med NGM medier, der har dehydreret tilstrækkeligt, at en original 10 ml volumen har en post-tørring volumen mellem 8,3-8,9 ml. Et alternativ til 2 timers tør tid er at tørre, indtil pladerne når dette volumenområde for at tage højde for forskelle i inkubatorer.
      3. Smelt 4 kobberringe (indvendig diameter på 1,6 cm) ind i overfladen af hver af pladerne for at fungere som corrals for de forskellige genotyper eller behandlingsgrupper af orme. Tag fat i hver ring med pincet, og varm i en flamme (en stærk flamme fra en Bunsen brænder fungerer godt) i ca 3 sek. Placer straks ringen på en plade, mens du stadig holder ringen med tangen for at forhindre den i at 'springe over'.
         1. Sørg for, at ringen hviler fladt mod overfladen af agaren ved at trykke forsigtigt ned med tangen flere steder på ringen. Når du placerer ringen, skal du sørge for at give plads til yderligere tre ringe.
         2. Smelt de tre ekstra kobberringe ind i overfladen af pladen, og sørg for at placere dem så tæt sammen som muligt, så alle fire vil være i synsfeltet af kameraet.
            BEMÆRK: At lave en god forsegling med agaren er afgørende for at holde ormene i ringene under analysen. Ringe, der springer rundt på pladen, er usandsynligt at lave den korrekte forsegling med agaren og kan ar agaren, hvilket gør det muligt for orme at grave og forstyrrer visualiseringen af ormene.
         3. For hver assay plade forberede en ledsagende "akklimatisering" plade, som skal tørres og unseeded og vil modtage nogen ethanol. Placer fire kobberringe på disse plader.
      4. Mærk bunden af pladerne ved siden af hver ring med ormen stamme, der skal anvendes i ringen, idet man sørger for ikke at skrive i synsfeltet af ringen selv. Match etiketterne på analysepladen med den tilhørende akklimatiseringsplade.
      5. Mængden af 100% ethanol, der skal tilsættes hver analyseplade, beregnes, så den endelige koncentration er 0 mM eller 400 mM ethanol (vægt til volumen). For hvert forsøg (n = 1) vil der være en 0 mM og en 400 mM ethanolplade; akklimatiseringsplader modtager ikke ethanol. Tilsæt ethanol, pipetter det rundt om overfladen af pladen. Brug laboratoriefilm til at forsegle pladen og lad den ekvilibrere på bordpladen i 2 timer.
      6. Når der er gået 1,5 timer, skal du begynde akklimatiseringstrinnet i analysen, trin 2.2.
   2. Udfør bevægelsesanalyse: Assay-plader
      1. Overfør forsigtigt 10 orme af hver eksperimentel gruppe til midten af en kobberring på akklimatiseringspladen. Fjern enhver mad, der er synlig på agaren på dette tidspunkt ved at skrabe forsigtigt med ormen pick. Varier den rækkefølge, hvori forsøgsgrupperne sættes på pladerne på tværs af eksperimentelle forsøg, så de samme stammer ikke sættes på pladerne i samme rækkefølge på tværs af forsøg.
         BEMÆRK: Målet er at overføre dyrene til pladen med minimale mængder mad, for hvis mad på akklimatiseringspladen overføres til analysepladen, samles ormene omkring fødevaren, og lægemidlets virkning på bevægelse vil blive skjult.
      2. Pas på ikke at bryde overfladen af agaren med plukket, da dette vil gøre det muligt for ormene at grave og forstyrre analysen. Inkuber ormene på RT i 30 min.
      3. Sørg for, at der er et passende interval mellem påbegyndelsen af hver plade. En erfaren forsøgsmand kan flytte 40 dyr, 10/ring i 4 ringe i < 1,5 min, men ethvert interval op til 2 min er acceptabelt. Standardanalysen har filmoptagelse på 10-12 min og 30-32 minutters eksponering for både 0 mM og 400 mM ethanol.
      4. Start akklimatiseringspladen for 0 mM eksponering og akklimatiseringspladen for 400 mM eksponering ca. 2 min og 30 sek fra hinanden for at give mulighed for at gemme den første filmfil, før den anden film skal begynde.
      5. Efter 30-minutters akklimatiseringsperioden overføres ormene fra akklimatiseringspladerne til assaypladerne. Ormene overføres til analysepladerne (0 mM eller 400 mM ethanol) i samme rækkefølge, som de blev tilsat akklimatiseringspladen, og hold styr på timingen mellem færdiggørelsen af hver plade. Forsegl pladen med laboratoriefilm for at minimere tab af ethanol til fordampning.
      6. Brug en scooping bevægelse med en tynd kantet flad orm pick til at indsamle orme på toppen af den flade pick. Udfør overførslen af orme fra den useedede akklimatiseringsplade til analysepladen uden brug af bakterier, som almindeligvis bruges til at overføre orme, da det hjælper med at lime ormen til plukket.
         BEMÆRK: Den hastighed, hvormed dyr overføres på dette trin, er meget vigtig, fordi de første orme på pladen vil blive udsat for ethanol længere end de sidste orme, der tilsættes pladen, og tidligere tidspunkter kan vise nogle tidsafhængige virkninger. Dette er hovedårsagen til at rotere, hvilke stammer der placeres på en plade først på tværs af eksperimentelle replikater.
   3. Udfør Locomotion Assay: Filme
      1. Brug et mikroskop / kamera kombination, der giver mulighed for samtidig billeddannelse af alle fire ringe i synsfeltet (ca. 42x42 mm² kvadrat), såsom en 0,5x mikroskop mål, 0,8 x forstørrelse og et kamera med en 2048x2048 7,4 μm pixel CCD.
      2. Brug jævn belysning på tværs af synsfeltet, hvilket hjælper med objektgenkendelse ved intensitetstærsklen. En 3 "x3" baggrundsbelysning fungerer godt.
      3. Billede ormene på en plade placeret mediesiden op (låg ned), som genererer kontrast, der går tabt, når du bruger baggrundsbelysningen sammenlignet med en traditionel mikroskop transmitteret lyskilde.
      4. Forbered billedanalysesoftwaren til at optage time-lapse-film af de bevægelige orme. Indstil softwaren til at tage 12-bit gråtonebilleder hvert 1 sekund som en 2-minutters (120-ramme) film. Hvis du vil reducere outputfilens størrelse, mens du stadig bevarer tilstrækkelig billedopløsning, skal du bruge en 2x2-placeringstilstand til at hente billeder på 1024 x 1024 pixel.
      5. Optag filmene. Begynd at optage en 120-frame film af den første plade (0 mM ethanol) 10 min efter de sidste orme blev placeret på denne plade. Gem filmfilen.
      6. Optag den anden plade (400 mM ethanol). Gentag denne proces for begge plader, der begynder 30 minutter efter, at de sidste orme blev placeret på den første plade (0 mM ethanol) for at fange 30-32 minutters tidspunkter for hver eksponering.
         BEMÆRK: Giv tilstrækkelig tid til at gemme billedfilerne efter hver hentningssession, før du begynder at optage den næste plade, der skal analyseres.
      7. Til fremtidssikring af arkiverede film og til at tillade, at disse film åbnes og analyseres af andre public source-open source-billedprogrammer, f.eks.
         BEMÆRK: Den billedanalysesoftware, der er beskrevet her, bruger et proprietært filformat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.