C. elegans Rastreamento de movimento: um método para avaliar a locomoção em worms

Overview

Este vídeo descreve o uso de software de vídeo e rastreamento para gravar o movimento do worm em uma arena.  O protocolo de exemplo mede o efeito da exposição ao etanol na locomoção de vermes.

Protocol

O protocolo a seguir é um trecho de Davies et al, An Assay for Measurement the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Passos a serem realizados no dia anterior ao ensaio

   1. Escolha vermes de estágio L4 para placas de médio de crescimento de nematoide fresco (NGM) semeadas com um gramado de OP50 E. coli, e cultue-os a 20 °C O/N. Cada condição de ensaio requer 10 vermes; escolher um excesso de worms para permitir a perda de O/N de worms.
      1. Apenas os animais de ensaio que são adultos do primeiro dia; muitos mutantes crescem a uma velocidade mais lenta do que o tipo selvagem. Ajuste o tempo de colheita para cepas que tenham atrasos no desenvolvimento para que todos os animais testados sejam adultos de primeiro dia.
2. Passos a serem realizados no Dia do Ensaio
   1. Preparação para o ensaio:
      1. Realize ensaios em placas padrão não semeadas de 60 x 15 mm de NGM. Seque todas as placas a serem usadas a 37 °C durante 2 horas, com tampas desligada. Para cada ensaio experimental, utilize quatro placas de NGM secos; estas serão as placas de ensaio de etanol de 0 mM e 400 mM e suas placas de aclimatação.
         NOTA: O uso de placas de GNM é importante aqui; diferenças na composição das placas, em particular sua osmolaridade, podem afetar fortemente a resposta da dose do etanol no comportamento, isso se deve, pelo menos em parte, a mudanças na quantidade de etanol acumulada pelos animais. NGM agar é 160 mOsm.
      2. Após a secagem, pese cada uma das placas de NGM não semeadas para serem usadas no ensaio e observe o peso. Determine o volume de mídia nas placas com base no peso de uma placa vazia. Para aproximar a conversão do peso do ágar em volume, suponha que a mídia pesa o mesmo que um volume igual de água.
         NOTA: Nossos resultados mais consistentes foram encontrados com a mídia NGM que desidratou o suficiente para que um volume original de 10 ml tenha um volume pós-secagem entre 8,3 e 8,9 ml. Uma alternativa ao tempo seco de 2 horas é secar até que as placas atinjam essa faixa de volume para explicar as diferenças nas incubadoras.
      3. Derreta 4 anéis de cobre (diâmetro interno de 1,6 cm) na superfície de cada uma das placas para atuar como currais para os diferentes genótipos ou grupos de tratamento de vermes. Segure cada anel com fórceps, e aqueça em uma chama (uma chama forte de um queimador de Bunsen funciona bem) por aproximadamente 3 segundos. Coloque imediatamente o anel em uma placa enquanto ainda segura o anel com os fórceps para evitar que ele 'pule'.
         1. Certifique-se de que o anel repousa contra a superfície do ágar pressionando suavemente com as fórceps em vários pontos do anel. Ao colocar o anel, tenha cuidado para deixar espaço para mais três anéis.
         2. Derreta os três anéis adicionais de cobre na superfície da placa, tomando o cuidado de colocá-los o mais próximo possível para que todos os quatro estejam no campo de visão da câmera.
            NOTA: Fazer um bom selo com o ágar é essencial para manter os vermes nos anéis durante o ensaio. Anéis que pulam na placa são improváveis de fazer o selo correto com o ágar e podem cicatrizar o ágar, o que permite que os vermes burrow e interfere na visualização dos vermes.
         3. Para cada placa de ensaio prepare uma placa de "aclimatação" que acompanha, que deve ser seca e não semeada e não receberá etanol. Coloque quatro anéis de cobre nestas placas.
      4. Rotule a parte inferior das placas ao lado de cada anel com a cepa de verme a ser usada no anel, tomando o cuidado de não escrever no campo de visão do próprio anel. Combine os rótulos na placa de ensaio com sua placa de aclimatação.
      5. Calcule a quantidade de 100% de etanol para adicionar a cada placa de ensaio para que a concentração final seja de 0 mM ou 400 mM de etanol (peso ao volume). Para cada experimento(n = 1), haverá uma placa de etanol de 0 mM e uma de 400 mM; as placas de aclimatação não recebem etanol. Adicione o etanol, canalizar-o ao redor da superfície da placa. Use filme de laboratório para selar a placa e deixe equilibrar na parte superior do banco por 2 horas.
      6. Quando 1,5 horas tiver transcorrido, inicie a etapa de aclimatação do ensaio, passo 2.2.
   2. Executar ensaio de locomoção: placas de ensaio
      1. Transfira cuidadosamente 10 vermes de cada grupo experimental para o centro de um anel de cobre na placa de aclimatação. Remova qualquer alimento visível no ágar neste momento raspando suavemente com a picareta de vermes. Varie a ordem em que os grupos experimentais são colocados nas placas através de ensaios experimentais para que as mesmas cepas não sejam colocadas nas placas na mesma ordem através dos ensaios.
         NOTA: O objetivo é transferir os animais para o prato com quantidades mínimas de alimentos, pois se o alimento na placa de aclimatação for transferido para a placa de ensaio os vermes se agregarão em torno da comida e o efeito da droga na locomoção será obscurecido.
      2. Tenha cuidado para não quebrar a superfície do ágar com a picareta, pois isso permitirá que os vermes se enterrem e interromperão o ensaio. Incubar os vermes na RT por 30 minutos.
      3. Certifique-se de que há um intervalo adequado entre as iniciações de cada placa. Um experimentador experiente pode mover 40 animais, 10/anel para 4 anéis em < 1,5 min, mas qualquer intervalo até 2 min é aceitável. O ensaio padrão tem filmes gravados em 10-12 min e 30-32 min de exposição para 0 mM e 400 mM de etanol.
      4. Inicie a placa de aclimatação para a exposição de 0 mM e a placa de aclimatação para a exposição de 400 mM aproximadamente 2 min e 30 seg de distância para permitir a salvação do primeiro arquivo de filme antes do segundo filme deve começar.
      5. Após o período de aclimatação de 30 minutos, transfira os vermes das placas de aclimatação para as placas de ensaio. Transfira os vermes para as placas de ensaio (0 mM ou 400 mM de etanol) na mesma ordem em que foram adicionados à placa de aclimatação, acompanhando o tempo entre as conclusões de cada placa. Sele a placa com filme de laboratório para minimizar a perda de etanol à vaporização.
      6. Use um movimento de colher com uma picareta de verme achatado de borda fina para coletar vermes em cima da picareta achatada. Realize a transferência de vermes da placa de aclimatação não semeada para a placa de ensaio sem o uso de bactérias, que é comumente usada na transferência de vermes, pois ajuda a colar o verme à picareta.
         NOTA: A velocidade com que os animais são transferidos nesta etapa é muito importante porque os primeiros vermes na placa serão expostos ao etanol por mais tempo do que os últimos vermes adicionados à placa, e os pontos de tempo anteriores podem mostrar alguns efeitos dependentes do tempo. Esta é a principal razão para girar quais cepas são colocadas em uma placa primeiro através de réplicas experimentais.
   3. Executar ensaio de locomoção: filmagens
      1. Use uma combinação de microscópio/câmera que permite imagens simultâneas de todos os quatro anéis no campo de visão (aproximadamente 42x42 mm² quadrados), como um objetivo de microscópio de 0,5x, ampliação de 0,8x e uma câmera com um CCD de 2048x2048 de 7,4 μm pixel.
      2. Use até mesmo iluminação em todo o campo de visão, o que auxilia no reconhecimento do objeto na etapa de limiar de intensidade. Uma luz de fundo de 3"x3" funciona bem.
      3. Imagem dos vermes em uma placa posicionada lado de mídia para cima (tampa para baixo), que gera contraste que é perdido ao usar a luz de fundo em comparação com uma fonte de luz tradicional transmitida por microscópio.
      4. Prepare o software de análise de imagens para capturar filmes de lapso de tempo dos worms em movimento. Defina o software para capturar imagens em escala cinza de 12 bits a cada 1 segundo, como um filme de 2 minutos (120 quadros). Para reduzir o tamanho do arquivo de saída, mantendo ainda a resolução de imagem suficiente, use um modo binning 2x2 para capturar imagens de 1024x1024 pixels.
      5. Grave os filmes. Comece a gravar um filme de 120 quadros da primeira placa (0 mM de etanol) 10 min depois que os últimos vermes foram colocados naquela placa. Salve o arquivo do filme.
      6. Registo a segunda placa (400 mM de etanol). Repita este processo para ambas as placas a partir de 30 minutos após os últimos vermes serem colocados na primeira placa (0 mM de etanol) para capturar os pontos de tempo de 30-32 min para cada exposição.
         NOTA: Deixe tempo suficiente para salvar os arquivos de imagem após cada sessão de captura antes de iniciar a gravação da próxima placa a ser analisada.
      7. Para a prova de futuro de filmes arquivados e para permitir que esses filmes sejam abertos e analisados por outros programas de software de imagem de código aberto de domínio público, como ImageJ, converta uma cópia de cada filme em arquivos TIFF em escala cinza de 8 bits.
         NOTA: O software de análise de imagem descrito aqui usa um formato de arquivo proprietário.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.