Overview
Cette vidéo présente les concepts derrière l’imagerie calcique et comprend un protocole d’exemple pour l’imagerie en accéléré des vers contenus dans les puits d’agarose moulés.
Protocol
Ce protocole est un extrait de Turek et coll., Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Imagerie calcique
- Utilisez des souches transgéniques exprimant des capteurs de calcium génétiquement codés tels que HBR16(goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]).
- Utilisez un microscope composé équipé pour l’épifluorescence à large champ. Connectez la sortie TTL de la caméra EMCCD à l’entrée TTL de la LED, de sorte que chaque fois que la caméra enregistre un cadre, l’échantillon sera éclairé. Utilisez un temps d’exposition d’environ 5 msec. Utilisez le gain EM de l’âge de 50 à 300.
- Spécifiez un film éclaté en cours d’exécution pendant 24 heures avec chaque ver étant photographié tous les 15 - 30 min d’abord pendant 20 sec avec DIC, puis pendant 20 sec avec une fluorescence GFP pour enregistrer GCaMP, puis prendre une image finale du signal mKate2 est prise pour contrôler les niveaux d’expression. Utilisez un taux d’image de 2/sec à chaque rafale.
- Pour l’inspection visuelle des données, utilisez une carte fausse couleur pour améliorer la visibilité des petits changements dans l’intensité de la fluorescence. Tracez des données fluorescentes sous le nom de ΔF/F, f étant la valeur de référence moyenne de la fluorescence. Une description détaillée de l’analyse des données calcique peut être trouvée dans la littérature.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
