Overview
Dieses Video stellt die Konzepte der Kalzium-Bildgebung vor und enthält ein Beispielprotokoll zur Zeitraffer-Bildgebung von Würmern, die in geformten Agarosebrunnen enthalten sind.
Protocol
Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. (2015).
1. Calcium Imaging
- Verwenden Sie transgene Stämme, die genetisch codierte Kalziumsensoren wie HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]) exdrücken.
- Verwenden Sie ein zusammengesetztes Mikroskop, das für die Breitfeldepifluoreszenz ausgestattet ist. Schließen Sie den TTL-Ausgang der EMCCD-Kamera an den TTL-Eingang der LED an, sodass jedes Mal, wenn die Kamera einen Rahmen aufzeichnet, das Sample beleuchtet wird. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von ca. 5 msec. Verwenden Sie EM-Verstärkung im Bereich von 50 - 300.
- Geben Sie einen Burst-Film an, der für 24 Stunden läuft, wobei jeder Wurm alle 15 - 30 min zuerst für 20 Sek. mit DIC, dann für 20 Sek. mit einer GFP-Fluoreszenz zur Aufzeichnung von GCaMP abgestellt wird, und dann ein endgültiges Bild des mKate2-Signals aufnehmen wird, um die Ausdrucksebenen zu steuern. Verwenden Sie eine Bildrate von 2/Sek. während jedes Bursts.
- Verwenden Sie für die visuelle Dateninspektion eine Falschfarbenkarte, um die Sichtbarkeit kleiner Änderungen der Fluoreszenzintensität zu verbessern. Zeichnen Sie fluoreszierende Daten als F/F, wobei F der durchschnittliche Basiswert der Fluoreszenz ist. Eine detaillierte Beschreibung der Kalziumdatenanalyse finden Sie in der Literatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
