Overview
סרטון זה מציג את המושגים שמאחורי הדמיית סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיה של תולעים הכלולות בבארות אגרוז מעוצבות.
Protocol
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Turek et al, Agarose Microchambers עבור הדמיית סידן לטווח ארוך של אלגנים Caenorhabditis, J. Vis. Exp. (2015).
1. דימות סידן
- השתמש בזנים מהונדסים המבטאים חיישני סידן מקודדים גנטית כגון HBR16(goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- השתמש במיקרוסקופ מורכב המצויד באפיפלואורסצנטיות רחבה. חבר את פלט ה- TTL של מצלמת EMCCD לקלט ה- TTL של ה- LED, כך שבכל פעם שהמצלמה תתעד מסגרת המדגם יואר. יש להשתמש בזמן חשיפה של כ-5 אלפיות שניה. השתמש רווח EM בטווח של 50 - 300.
- ציין סרט פרץ פועל במשך 24 שעות עם כל תולעת להיות בתמונה כל 15 - 30 דקות תחילה במשך 20 שניות עם DIC, ולאחר מכן במשך 20 שניות עם פלואורסצנטיות GFP להקליט GCaMP, ולאחר מכן לקחת תמונה סופית של אות mKate2 נלקח כדי לשלוט עבור רמות הביטוי. השתמש בקצב מסגרות של 2/שניה במהלך כל פרץ.
- לבדיקת נתונים חזותיים, השתמש במפת צבעים כוזבים כדי לשפר את הניראות של שינויים קטנים בעוצמת הפלואורסצנטיות. התווה נתוני פלואורסצנט כ- ΔF/F, כאשר F הוא הערך הבסיסי הממוצע של פלואורסצנטיות. תיאור מפורט של ניתוח נתוני סידן ניתן למצוא בספרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
