Overview
이 비디오는 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형 아가로즈 우물에 포함 된 벌레의 시간 경과 이미징을위한 예제 프로토콜을 포함합니다.
Protocol
이 프로토콜은 Turek 외, 카노르하비디스 엘레건의장기 칼슘 이미징을 위한 아가로즈 마이크로챔버, J. Vis. Exp에서 발췌한 것입니다. (2015).
1. 칼슘 이미징
- HBR16(goeIs5[pnmr-1:SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)])와같은 유전자 로 인코딩된 칼슘 센서를 발현하는 형질균을 사용합니다.
- 넓은 필드 에피플루오를 위해 장착된 복합 현미경을 사용하십시오. EMCCD 카메라의 TTL 출력을 LED의 TTL 입력에 연결하여 카메라가 프레임을 기록할 때마다 샘플이 조명되도록 합니다. 약 5msec의 노출 시간을 사용합니다. 50 - 300 의 범위에서 EM 게인을 사용합니다.
- 각 웜이 DIC를 사용하여 20초마다 15~30분씩 먼저 이미지화되는 버스트 영화를 지정한 다음 GFP 형광으로 20초 동안 GCaMP를 기록한 다음 mKate2 신호의 최종 이미지를 촬영하여 발현 레벨을 제어합니다. 각 버스트 동안 2/초의 프레임 속도를 사용합니다.
- 시각적 데이터 검사의 경우 false-color 맵을 사용하여 형광 강도의 작은 변경 사항을 확인합니다. 형광 데이터를 ΔF/F로 플롯하며 F는 형광의 평균 기준값입니다. 칼슘 데이터 분석에 대한 자세한 설명은 문헌에서 찾을 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
