Overview
Denne videoen introduserer begrepene bak kalsiumavbildning og inkluderer en eksempelprotokoll for tidsforløpavbildning av ormer som finnes i støpte agarosebrønner.
Protocol
Denne protokollen er et utdrag fra Turek et al, Agarose Microchambers for Langsiktig Kalsium Imaging av Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Kalsiumavbildning
- Bruk transgene stammer som uttrykker genetisk kodede kalsiumsensorer som HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Bruk et sammensatt mikroskop utstyrt for bredfelt epifluorescens. Koble TTL-utgangen til EMCCD-kameraet til TTL-inngangen til LED-lampen, slik at hver gang kameraet tar opp et bilde, vil prøven lyse. Bruk en eksponeringstid på ca. 5 msek. Bruk EM-forsterkning i området 50 - 300.
- Angi en burst-film som kjører i 24 timer, der hver orm blir avbildet hver 15- 30 min først i 20 sek med DIC, deretter i 20 sek med en GFP-fluorescens for å spille inn GCaMP, og ta deretter et endelig bilde av mKate2-signalet er tatt for å kontrollere for uttrykksnivåer. Bruk en bildefrekvens på 2/sek under hver serie.
- For visuell datainspeksjon, bruk et falskt fargekart for å forbedre synligheten av små endringer i fluorescensintensiteten. Plott fluorescerende data som ΔF/F, der F er den gjennomsnittlige grunnlinjeverdien av fluorescens. En detaljert beskrivelse av kalsiumdataanalyse finnes i litteraturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
