Overview
Este vídeo introduz os conceitos por trás da imagem de cálcio e inclui um protocolo de exemplo para imagens de lapso de tempo de vermes contidos em poços de agarose moldados.
Protocol
Este protocolo é um trecho de Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Imagem de cálcio
- Use cepas transgênicas expressando sensores de cálcio geneticamente codificados, como HBR16 (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
- Use um microscópio composto equipado para epifluorescência de campo largo. Conecte a saída TTL da câmera EMCCD à entrada TTL do LED, de modo que cada vez que a câmera registrar um quadro a amostra será iluminada. Use um tempo de exposição de cerca de 5 msec. Use o ganho EM na faixa de 50 a 300.
- Especifique um filme de explosão rodando por 24 horas com cada worm sendo imageado a cada 15 - 30 min primeiro por 20 segundos com DIC, depois por 20 segundos com uma fluorescência GFP para gravar GCaMP, e, em seguida, tomar uma imagem final do sinal mKate2 é tomada para controlar para níveis de expressão. Use uma taxa de quadros de 2/seg durante cada explosão.
- Para inspeção de dados visuais, use um mapa de cores falsas para melhorar a visibilidade de pequenas mudanças na intensidade da fluorescência. Plotar dados fluorescentes como ΔF/F, sendo F o valor médio da linha de base da fluorescência. Uma descrição detalhada da análise de dados de cálcio pode ser encontrada na literatura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
