ג. אלגנים מדידות אזור שרירים: שיטה מתוקננת לכימות מורפולוגיה של שרירים מפוסטרים

Overview

C. אלגנים יש שני סוגים של שרירים, סרקומר יחיד סרקומר מרובים, או שרירים מפוסלים.  סרטון זה מתאר את הסידור של שרירי דופן הגוף מפוסטרים, אשר אחראים על תנועה של תולעת'וכולל פרוטוקול מדגם כדי למדוד מורפולוגיה שרירים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

Protocol

פרוטוקול זה מובא מתוך Teoh et al, גישות כמותיות לחקר מבנים תאיים ומורפולוגיה Organelle ב Caenorhabditis אלגנס, J. Vis. Exp. (2019).

1. כימות מבנה השרירים של דופן הגוף

1. הדמיית פלואורסצנטיות של מבנה שריר דופן הגוף
   1. השג זן (לדוגמה, RW1596) הנושא את stEx30 טרנסג'ין(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), אשר מתייג סיבי מיוסין עם GFP.
      שים לב: הכנסת הטרנסג'ין לבעלי חיים יכולה להיות מושגת על ידי חציית זן של עניין עם בעלי חיים שכבר מבטאים את הטרנסג'ין, או מיקרו-אינפיינטינג של דנ"א לזרוע הדיסטלית של הגונד. פנוטיפ 'מתגלגל' המושרה על ידי מוטציה rol-6 בטרנג'ן זה מקל על הדמיה של השרירים. שרירי דופן הגוף רצים לאורך הצדדים הגביים והגחופיים שבדרך כלל מונעים מהם לראות בעלי חיים מסוג פראי מכיוון שהם בדרך כלל שוכבים על אחד הצדדים הצדדיים שלהם. אלל rol-6(su1006) גורם פיתול של בעלי החיים, ובכך חושף כמה תאי שרירים להדמיה.
   2. תמונה את בעלי החיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשילוב עם מצלמה ברזולוציה גבוהה התקן מצמד טעון (CCD), אובייקטיבי 40X ומעלה, תוכנת מסנן ורכישה GFP.
   3. כוונן את זמן החשיפה ואת עוצמת התאורה כדי למנוע תמונות רוויות יתר.
   4. ללכוד ולשמור תמונות של השרירים (הגדלה 400X) מחלק של החיה המכיל לפחות אחד שלם גלוי תא שריר אלכסוני. הימנע מאזורים עם תא שריר יחיד שאינו שלם או מקטעים שאינם בפוקוס. גם לא לכלול תמונות מאזורים קיצוניים 50 ו אחוריים, ואזורים הסמוכים הפות.
      שים לב: אם לבעל החיים אין תא שריר שלם גלוי אחד, החלק בעדינות את הכיסוי כדי להפוך את החיה כדי לחשוף תא שלם.
2. מדידת אזור תאי השריר
   1. פתח את התמונה בתוכנת פיג'י (גרסה 2.0.0 שימש במחקר זה).
   2. השתמש בבחירת המצולע כדי לעקוב בזהירות סביב תא שריר אלכסוני יחיד. התאם את קו המצולע בסוף על-ידי גרירת נקודת העיגון כדי לשפר את העקיבה.
   3. עבור לכרטיסיה נתח בחלק העליון של התוכנה ולחץ על מדידה כדי לחשב את אזור הבחירה. תוצג טבלת תוצאות נפרדת המכילה את האזור ומידות אחרות. אם מדידת האזור חסרה בטבלת התוצאות, עבור אל הגדרת מידות תחת הכרטיסיה ניתוח ובדוק שהתיבה אזור מסומנת. כמו כן, שחרר מדידות אחרות שאינן נחוצות.
   4. לתאי שריר עם אזור מנוון/חסר, עקבו אחר האזור החסר בעזרת הכלי לבחירת מצולע ולחצו שוב על 'מדידה'. אם קיימים רווחים מרובים בתוך התא, עקוב אחר כל רווח בנפרד.
   5. חשב את היחס בין אזור הפער לתא השריר הבודד כולו. יחס גבוה מצביע על היקף גבוה יותר של ניוון שרירים עקב פערים גדולים בתוך התא. אם אין אזורים חסרים, כפי שניתן לראות בדרך כלל בבעלי חיים מסוג בר, היחס יחושב כאפס.
      שים לב: כפקד, ציון גם עבור פגמים מבנה שריר חזותית ולהשוות תוצאות עם המדידה הכמותית. זה שימושי במיוחד אם המתח נחקר בפעם הראשונה במעבדה. עבור ניקוד פנוטיפי, להעריך את בעלי החיים כמו פגום או לא פגום מבוסס על שלמות הסיבים. לדוגמה, בעלי חיים עם אובדן של פסים חוטים ברורים, גוש GFP, או פערים בתוך תאי שריר עקב התמוטטות מבנית, יהיה הבקיע פגום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40