Overview
C. gli elegani hanno due tipi di muscoli, sarcomero singolo e sarcomero multiplo o muscoli striati. Questo video descrive la disposizione dei muscoli striati della parete corporea, che sono responsabili dellalocomozione diun verme e include un protocollo di esempio per misurare la morfologia muscolare usando il software di analisi delle immagini.
Protocol
Questo protocollo è tratto da Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Quantificare la struttura muscolare della parete corporea
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Imaging a fluorescenza della struttura muscolare della parete corporea
- Ottenere un ceppo (ad esempio, RW1596) che trasporta il transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), che etichetta le fibre di miosina con GFP.
NOTA: L'introduzione del transgene negli animali può essere ottenuta incrociando un ceppo di interesse con animali che già esprimono il transgene o microiniettando il DNA nel braccio distale della gonadi. Il fenotipo 'rotolante' indotto dalla mutazione rol-6 in questo transgene facilita la visualizzazione dei muscoli. I muscoli delle pareti del corpo corrono lungo i lati dorsale e ventrale che normalmente sono preclusi dalla vista negli animali di tipo selvatico perché in genere giacciono su uno dei loro lati laterali. L'allele rol-6 (su1006) induce la torsione degli animali, esponendo così alcune cellule muscolari per l'imaging. - Immagini gli animali utilizzando un microscopio a fluorescenza accoppiato con una telecamera a dispositivo accoppiato caricato ad alta risoluzione (CCD), obiettivo 40X o superiore, filtro GFP e software di acquisizione.
- Regolare il tempo di esposizione e l'intensità dell'illuminazione per evitare immagini sovrasature.
- Cattura e salva immagini di muscoli (ingrandimento 400X) da una sezione dell'animale contenente almeno una cellula muscolare obliqua visibile completa. Evitare le regioni con una singola cellula muscolare incomplete o sezioni non a fuoco. Escludere anche le immagini dalle regioni anteriori e posteriori estreme e dalle regioni adiacenti alla vulva.
NOTA: Se l'animale non ha una singola cellula muscolare completa visibile, far scorrere delicatamente il coverslip per girare l'animale in modo da esporre una cellula completa.
- Ottenere un ceppo (ad esempio, RW1596) che trasporta il transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), che etichetta le fibre di miosina con GFP.
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Misurazione dell'area delle cellule muscolari
- Aprire l'immagine nel software Fiji (la versione 2.0.0 è stata utilizzata in questo studio).
- Utilizzare la selezione poligonale per tracciare attentamente intorno a una singola cellula muscolare obliqua. Regolare la linea del poligono alla fine trascinando il punto di ancoraggio per migliorare la tracciatura.
- Passare alla scheda Analizza nella parte superiore del software e fare clic su Misura per calcolare l'area della selezione. Verrà mostrata una tabella dei risultati separata contenente l'area e altre misurazioni. Se la misurazione dell'area non è presente nella tabella dei risultati, passare a Imposta misurazioni nella scheda Analizza e verificare che la casella di controllo dell'area sia spuntata. Allo stesso modo, deselezionare altre misurazioni che non sono necessarie.
- Per le cellule muscolari con una regione degenerata/mancante, tracciate l'area mancante con lo strumento di selezione poligonale e fate di nuovo clic su Misura (Measure). Se ci sono più spazi all'interno della cella, traccia ogni gap separatamente.
- Calcola il rapporto tra l'area dello spazio e l'intera singola cellula muscolare. Un rapporto elevato indica una maggiore estensione della degenerazione muscolare a causa di grandi spazi vuoti all'interno della cellula. Se non ci sono regioni mancanti, come comunemente si vede negli animali di tipo selvatico, il rapporto sarebbe calcolato come zero.
NOTA: Come controllo, segnare anche per i difetti della struttura muscolare visivamente e confrontare i risultati con la misurazione quantitativa. Ciò è particolarmente utile se il ceppo viene studiato per la prima volta in laboratorio. Per il punteggio fenotipico, valutare gli animali come difettosi o non difettosi in base all'integrità dei filamenti. Ad esempio, gli animali con perdita di striature di filamenti distinte, grumi di GFP o spazi vuoti all'interno delle cellule muscolari a causa di guasti strutturali, sarebbero segnati come difettosi.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 |