C. elegans Muskelbereichsmessungen: Eine standardisierte Methode zur Quantifizierung der gestreiften Muskelmorphologie

Overview

C. Elegane haben zwei Arten von Muskeln, einzelne Sarcomere und multiple Sarcomere, oder gestreifte Muskeln.  Dieses Video beschreibt die Anordnung der gestreiften Körperwandmuskeln, die für die Fortbewegung einesWurmsverantwortlich sind, und enthält ein Beispielprotokoll zur Messung der Muskelmorphologie mit Hilfe einer Bildanalysesoftware.

Protocol

Dieses Protokoll ist aus Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. (2019).

1. Quantifizierung der Körperwandmuskelstruktur

1. Fluoreszenzbildgebung der Körperwandmuskelstruktur
   1. Erhalten Sie einen Stamm (z. B. RW1596), der das Transgen stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))trägt, der Myosinfasern mit GFP kennzeichnet.
      HINWEIS: Die Einführung des Transgens in Tiere kann erreicht werden, indem entweder ein Voninteressemitstamm mit Tieren, die bereits das Transgen ausdrücken, oder mikroinjiziert DNA in den distalen Arm des Gonaden. Der durch die Rol-6-Mutation in diesem Transgen induzierte "rollende" Phänotyp erleichtert die Visualisierung der Muskeln. Die Körperwandmuskeln verlaufen entlang der rückenförmigen und ventralen Seiten, die normalerweise von der Sicht bei Wildtieren ausgeschlossen sind, weil sie in der Regel auf einer ihrer Seiten liegen. Das Rol-6(su1006) Allel induziert eine Verdrehung der Tiere und setzt so einige Muskelzellen für die Bildgebung frei.
   2. Stellen Sie die Tiere mit einem Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einer hochauflösenden charged gekoppelten Gerätekamera (CCD), 40X objektiv oder höher, GFP-Filter- und Erfassungssoftware auf.
   3. Passen Sie die Belichtungszeit und Die Beleuchtungsstärke an, um übersättigte Bilder zu vermeiden.
   4. Erfassen und speichern Sie Bilder von Muskeln (400X Vergrößerung) von einem Abschnitt des Tieres, der mindestens eine vollständig sichtbare schräge Muskelzelle enthält. Vermeiden Sie Regionen mit einer einzelnen Muskelzelle, die unvollständig ist, oder Abschnitte, die nicht im Fokus stehen. Schließen Sie auch Bilder aus extremen vorderen und hinteren Regionen und Regionen aus, die an die Vulva angrenzen.
      HINWEIS: Wenn das Tier keine einzige sichtbare vollständige Muskelzelle hat, schieben Sie vorsichtig den Coverslip, um das Tier zu drehen, um eine vollständige Zelle freizulegen.
2. Messung des Muskelzellbereichs
   1. Öffnen Sie das Bild in Fidschi-Software (Version 2.0.0 wurde in dieser Studie verwendet).
   2. Verwenden Sie die Polygonauswahl, um eine einzelne schräge Muskelzelle sorgfältig nachzuverfolgen. Passen Sie die Linie des Polygons am Ende an, indem Sie den Ankerpunkt ziehen, um die Ablaufverfolgung zu verbessern.
   3. Wechseln Sie oben in der Software zur Registerkarte Analysieren, und klicken Sie auf Messen, um den Bereich der Auswahl zu berechnen. Eine separate Ergebnistabelle mit dem Bereich und anderen Messungen wird angezeigt. Wenn die Flächenmessung in der Ergebnistabelle fehlt, gehen Sie unter der Registerkarte Analysieren zuMessungen festlegen,und überprüfen Sie, ob das Bereichsfeld angekreuzt ist. Deaktivieren Sie auch andere Messungen, die nicht benötigt werden. 
   4. Verfolgen Sie bei Muskelzellen mit einem degenerierten/fehlenden Bereich den fehlenden Bereich mit dem Polygonauswahlwerkzeug, und klicken Sie erneut auf Messen. Wenn sich mehrere Lücken innerhalb der Zelle befinden, verfolgen Sie jede Lücke separat.
   5. Berechnen Sie das Verhältnis der Lückenfläche zur gesamten Einzelmuskelzelle. Ein hohes Verhältnis deutet auf ein höheres Ausmaß der Muskeldegeneration aufgrund großer Lücken in der Zelle hin. Wenn keine Regionen fehlen, wie sie bei Wildtieren häufig zu beobachten sind, würde das Verhältnis als Null berechnet.
      HINWEIS: Als Kontrolle, Punkten Sie auch für Muskelstrukturdefekte visuell und vergleichen Sie die Ergebnisse mit der quantitativen Messung. Dies ist besonders nützlich, wenn die Sorte zum ersten Mal im Labor untersucht wird. Bewerten Sie die Tiere bei der phänotischen Bewertung aufgrund der Integrität der Filamente als defekt oder nicht fehlerhaft. Beispielsweise würden Tiere mit verlustbaren Filamentstorten, GFP-Klumpen oder Lücken in Muskelzellen aufgrund struktureller Ausfälle als defekt bewertet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40