C.エレガンス筋領域測定:線条筋形態を定量化する標準化された方法

Overview

C.エレガンスは 、単一のサルコメアと複数のサルコメア、または線条筋の2種類の筋肉を有する。 このビデオでは、ワームの移動を担当する、画像解析ソフトウェアを使用して筋肉の形態を測定するサンプル プロトコルを含む、縞状の体壁の筋肉の配置について説明します。

Protocol

このプロトコルは、Teohら、ケノハブディティス・エレガンスにおける細胞構造およびオルガネラ形態学を研究するための定量的アプローチ、J.Vis.Expから抜粋されている。(2019). 

1. 体壁筋構造の定量化

1. 体壁筋構造の蛍光イメージング 
   1. GFPでミオシン繊維にラベルを付けるトランスジーンstEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))を運ぶ株(例えば、RW1596)を取得します。
      注: 動物への導入遺伝子の導入は、既にトランスジーンを発現している動物と関心のある株を交わるか、生殖腺の遠位アームにDNAをマイクロ注入することによって達成することができる。このトランスジーンにおけるrol-6突然変異によって誘導される「転がり」表現型は、筋肉の視覚化を促進する。体壁の筋肉は、通常、彼らの側側の1つに横たわっているため、通常は野生型動物の視界から排除されている側側と腹側に沿って走ります。rol-6(su1006)アリールは動物のねじれを誘発し、それによっていくつかの筋肉細胞を画像化のために露出させる。
   2. 蛍光顕微鏡を使用して、高解像度の荷電結合デバイスカメラ(CCD)、40X目的以上、GFPフィルターおよび取得ソフトウェアを組み合わせた動物を画像化します。
   3. 露出時間と照明強度を調整して、過飽和画像を防ぎます。
   4. 動物の少なくとも1つの完全な可視斜筋細胞を含む一部の筋肉(400X倍率)の画像をキャプチャして保存します。不完全な単一の筋肉細胞またはフォーカスがずれている部分を持つ領域は避けてください。また、極端な前および後部領域からの画像、および外陰部に隣接する領域から画像を除外します。
      注: 動物が単一の可視完全な筋肉細胞を持っていない場合は、完全な細胞を露出するように動物を回すためにカバースリップをそっとスライドさせます。
2. 筋細胞領域の測定
   1. フィジーのソフトウェアで画像を開きます(バージョン2.0.0はこの調査で使用されました)。
   2. ポリゴン選択を使用して、単一の斜体の筋肉セルを慎重にトレースします。アンカー ドットをドラッグして、最後のポリゴンのラインを調整してトレースを改善します。
   3. ソフトウェアの上部にある[分析] タブに移動し、[測定] をクリックして、選択した領域を計算します。面積とその他の測定値を含む別の結果表が表示されます。結果表に面積の測定値がない場合は、「分析」タブの「測定の設定」に移動し、エリア・ボックスにチェックマークが付いているか確認します。同様に、必要のない他の測定値のチェックを解除します。 
   4. 脱退/欠損領域の筋肉セルの場合、ポリゴン選択ツールで欠落した領域をトレースし、もう一度[測定]をクリックします。セル内に複数のギャップがある場合は、各ギャップを個別にトレースします。
   5. 単一の筋肉細胞全体に対するギャップ領域の比率を計算します。比率が高い場合、細胞内の大きな隙間による筋肉変性の範囲が高いことを示します。野生型動物に一般的に見られるように、不足している領域がない場合、比率はゼロとして計算されます。
      注: コントロールとして、筋構造欠陥についても目視でスコアを付け、定量測定と結果を比較する。これは、ひずみが実験室で初めて研究されている場合に特に便利です。表現性スコアリングの場合、フィラメントの完全性に基づいて動物を欠陥または欠陥がないとして評価します。例えば、特徴的なフィラメントの線条、GFP凝集、または構造的崩壊による筋肉細胞内の隙間が失われた動物は、欠陥があるとスコア付けされるであろう。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40