Medidas da área muscular de C. elegans: um método padronizado para quantificar a morfologia muscular estriada

Overview

C. elegans têm dois tipos de músculos, sarcomere único e múltiplo sarcomere, ou músculos estriados.  Este vídeo descreve o arranjo dos músculos da parede corporal estriadas, que são responsáveis pela locomoçãodeum verme e inclui um protocolo de amostra para medir a morfologia muscular usando o software de análise de imagem.

Protocol

Este protocolo é extraído de Teoh et al, Abordagens Quantitativas para Estudo de Estruturas Celulares e Morfologia organela em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Quantificando a estrutura muscular da parede corporal

1. Imagem de fluorescência da estrutura muscular da parede corporal
   1. Obtenha uma cepa (por exemplo, RW1596) carregando o transgene stEx30 (Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), que rotula fibras de miosina com GFP.
      NOTA: A introdução do transgêgênio em animais pode ser alcançada cruzando uma variedade de interesse com animais que já expressam o transgene, ou microinjetando DNA no braço distal da gônada. O fenótipo 'rolando' induzido pela mutação rol-6 neste transgene facilita a visualização dos músculos. Os músculos da parede do corpo correm ao longo dos lados dorsal e ventral que normalmente são impedidos de ver em animais do tipo selvagem porque eles normalmente se deitam em um de seus lados laterais. O alelo rol-6(su1006) induz a torção dos animais, expondo assim algumas células musculares para a imagem.
   2. Imagem dos animais usando um microscópio de fluorescência juntamente com uma câmera de dispositivo acoplada (CCD), objetivo de 40X ou superior, filtro GFP e software de aquisição.
   3. Ajuste o tempo de exposição e a intensidade de iluminação para evitar imagens supersaturadas.
   4. Capturar e salvar imagens de músculos (ampliação de 400X) de uma seção do animal contendo pelo menos uma célula muscular oblíqua visível completa. Evite regiões com uma única célula muscular incompleta ou seções que estejam fora de foco. Também excluem imagens de regiões extremas anteriores e posteriores, e regiões adjacentes à vulva.
      NOTA: Se o animal não tiver uma única célula muscular completa visível, deslize suavemente a mancha de cobertura para girar o animal de modo a expor uma célula completa.
2. Medição da área celular muscular
   1. Abra a imagem no software Fiji (a versão 2.0.0 foi usada neste estudo).
   2. Use a seleção do polígono para rastrear cuidadosamente em torno de uma única célula muscular oblíqua. Ajuste a linha do polígono no final arrastando o ponto de âncora para melhorar o rastreamento.
   3. Vá para Analisar a guia na parte superior do software e clique em Medir para calcular a área da seleção. Uma tabela de resultados separada contendo a área e outras medidas será mostrada. Se a medição da área estiver faltando na tabela de resultados, vá para Definir Medidas sob a guia Analisar e verifique se a caixa de área está marcada. Da mesma forma, despir outras medidas que não são necessárias.
   4. Para células musculares com região degenerada/ausente, rastreie a região ausente com a ferramenta de seleção do polígono e clique em Medir novamente. Se houver múltiplas lacunas dentro da célula, rastreie cada lacuna separadamente.
   5. Calcule a razão da área de gap para toda a célula muscular única. Uma alta proporção indica maior extensão da degeneração muscular devido a grandes lacunas dentro da célula. Se não houver regiões ausentes, como comumente visto em animais do tipo selvagem, a razão seria calculada como zero.
      NOTA: Como controle, escore também para defeitos de estrutura muscular visualmente e compara resultados com a medição quantitativa. Isso é especialmente útil se a cepa estiver sendo estudada pela primeira vez no laboratório. Para pontuação fenotípica, avalie os animais como defeituosos ou não defeituosos com base na integridade dos filamentos. Por exemplo, animais com perda de estrias de filamentos distintos, aglomerados de GFP ou lacunas dentro das células musculares devido à quebra estrutural, seriam pontuados como defeituosos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40