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Encyclopedia of Experiments

C. elegans 肌肉区域测量:量化条纹肌肉形态的标准化方法

Overview

C. elegans 有两种类型的肌肉,单肉瘤和多个肉瘤,或条纹肌肉。 这段视频描述了条纹身体壁肌肉的排列,这些肌肉负责蠕虫的运动,并包括一个使用图像分析软件测量肌肉形态的示例协议。

Protocol

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本协议摘自Teoh等人,定量方法研究细胞结构和细胞形态学在卡诺哈布迪蒂斯电子人,J.Vis.Exp。(2019). 

1. 量化体壁肌肉结构

  1. 身体壁肌肉结构的荧光成像 
    1. 获得携带转基因stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 +rol-6(su1006)的菌株(例如RW1596),该菌株用GFP标记肌素纤维。
      注: 将转基因引入动物可以通过与已经表达转基因的动物交叉产生兴趣,或者将DNA微注入性腺的分离臂来实现。这种转基因基因中罗尔-6突变引起的"滚动"表型有助于肌肉的可视化。身体壁肌肉沿着通常被排除在野生动物视野之外的躯干和腹侧运行,因为它们通常位于横向侧面。rol-6 (su1006)等位基因诱导动物扭曲,从而暴露一些肌肉细胞进行成像。
    2. 使用荧光显微镜与高分辨率带电耦合设备摄像头 (CCD)、40 倍目标或更高、GFP 过滤和采集软件对动物进行成像。
    3. 调整曝光时间和照明强度,防止图像过度饱和。
    4. 从包含至少一个完整的可见斜肌细胞的动物部分捕获并保存肌肉图像(400倍放大)。避免使用单个肌肉细胞不完整的区域或注意力不集中的部分。还排除来自极端前后区域以及外阴相邻区域的图像。
      注: 如果动物没有一个可见的完整的肌肉细胞,轻轻地滑动盖片,使动物,以暴露一个完整的细胞。
  2. 肌肉细胞区域测量
    1. 打开斐济软件中的图像(本研究中使用了版本 2.0.0)。
    2. 使用多边形选择仔细跟踪单个斜肌细胞周围。通过拖动锚点来调整末端多边形的线条,以改善跟踪。
    3. 转到软件顶部的"分析"选项卡,然后单击"量度"以计算选择的区域。将显示包含该区域和其他测量的单独结果表。如果结果表中缺少区域测量,请转到分析选项卡下的"设置测量",并检查区域框是否勾选。同样,取消对不需要的其他测量。 
    4. 对于有退化/缺失区域的肌肉细胞,使用多边形选择工具跟踪缺失区域,然后再次单击"测量"。如果细胞内存在多个间隙,则分别跟踪每个间隙。
    5. 计算间隙面积与整个单肌肉细胞的比率。高比率表示由于细胞内有较大间隙,肌肉退化程度较高。如果没有缺失区域,如野生类动物通常看到的,该比率将计算为零。
      注: 作为一种控制,得分还对肌肉结构缺陷进行视觉和比较结果与定量测量。如果首次在实验室中研究菌株,这尤其有用。对于表型评分,根据细丝的完整性评估动物有缺陷或无缺陷。例如,由于结构断裂而失去明显细丝条纹、GFP团块或肌肉细胞间隙的动物会被评分为有缺陷。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Leica TCS SP8 Inverted platform
Fluorescence microscope Carl Zeiss AG Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1 Thermo scientifique MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5 Zeiss 474030-9000-000 Made by SCHOTT
Glass slides Thermo scientifique MENS41104A/40

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