C. elegans Muscle Area Measurements: Un metodo standardizzato per quantificare la morfologia muscolare striata

Overview

C. gli elegani hanno due tipi di muscoli, sarcomero singolo e sarcomero multiplo o muscoli striati.  Questo video descrive la disposizione dei muscoli striati della parete corporea, che sono responsabili dellalocomozione diun verme e include un protocollo di esempio per misurare la morfologia muscolare usando il software di analisi delle immagini.

Protocol

Questo protocollo è tratto da Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Quantificare la struttura muscolare della parete corporea

1. Imaging a fluorescenza della struttura muscolare della parete corporea
   1. Ottenere un ceppo (ad esempio, RW1596) che trasporta il transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006)), che etichetta le fibre di miosina con GFP.
      NOTA: L'introduzione del transgene negli animali può essere ottenuta incrociando un ceppo di interesse con animali che già esprimono il transgene o microiniettando il DNA nel braccio distale della gonadi. Il fenotipo 'rotolante' indotto dalla mutazione rol-6 in questo transgene facilita la visualizzazione dei muscoli. I muscoli delle pareti del corpo corrono lungo i lati dorsale e ventrale che normalmente sono preclusi dalla vista negli animali di tipo selvatico perché in genere giacciono su uno dei loro lati laterali. L'allele rol-6 (su1006) induce la torsione degli animali, esponendo così alcune cellule muscolari per l'imaging.
   2. Immagini gli animali utilizzando un microscopio a fluorescenza accoppiato con una telecamera a dispositivo accoppiato caricato ad alta risoluzione (CCD), obiettivo 40X o superiore, filtro GFP e software di acquisizione.
   3. Regolare il tempo di esposizione e l'intensità dell'illuminazione per evitare immagini sovrasature.
   4. Cattura e salva immagini di muscoli (ingrandimento 400X) da una sezione dell'animale contenente almeno una cellula muscolare obliqua visibile completa. Evitare le regioni con una singola cellula muscolare incomplete o sezioni non a fuoco. Escludere anche le immagini dalle regioni anteriori e posteriori estreme e dalle regioni adiacenti alla vulva.
      NOTA: Se l'animale non ha una singola cellula muscolare completa visibile, far scorrere delicatamente il coverslip per girare l'animale in modo da esporre una cellula completa.
2. Misurazione dell'area delle cellule muscolari
   1. Aprire l'immagine nel software Fiji (la versione 2.0.0 è stata utilizzata in questo studio).
   2. Utilizzare la selezione poligonale per tracciare attentamente intorno a una singola cellula muscolare obliqua. Regolare la linea del poligono alla fine trascinando il punto di ancoraggio per migliorare la tracciatura.
   3. Passare alla scheda Analizza nella parte superiore del software e fare clic su Misura per calcolare l'area della selezione. Verrà mostrata una tabella dei risultati separata contenente l'area e altre misurazioni. Se la misurazione dell'area non è presente nella tabella dei risultati, passare a Imposta misurazioni nella scheda Analizza e verificare che la casella di controllo dell'area sia spuntata. Allo stesso modo, deselezionare altre misurazioni che non sono necessarie.
   4. Per le cellule muscolari con una regione degenerata/mancante, tracciate l'area mancante con lo strumento di selezione poligonale e fate di nuovo clic su Misura (Measure). Se ci sono più spazi all'interno della cella, traccia ogni gap separatamente.
   5. Calcola il rapporto tra l'area dello spazio e l'intera singola cellula muscolare. Un rapporto elevato indica una maggiore estensione della degenerazione muscolare a causa di grandi spazi vuoti all'interno della cellula. Se non ci sono regioni mancanti, come comunemente si vede negli animali di tipo selvatico, il rapporto sarebbe calcolato come zero.
      NOTA: Come controllo, segnare anche per i difetti della struttura muscolare visivamente e confrontare i risultati con la misurazione quantitativa. Ciò è particolarmente utile se il ceppo viene studiato per la prima volta in laboratorio. Per il punteggio fenotipico, valutare gli animali come difettosi o non difettosi in base all'integrità dei filamenti. Ad esempio, gli animali con perdita di striature di filamenti distinte, grumi di GFP o spazi vuoti all'interno delle cellule muscolari a causa di guasti strutturali, sarebbero segnati come difettosi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Leica	TCS SP8	Inverted platform
Fluorescence microscope	Carl Zeiss AG	Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40