Overview
يقدم هذا الفيديو طريقة للإصابة بالليزر ، والتي تستخدم للتسبب في إصابات دقيقة للغاية في البشرة الدودية. بروتوكول العينة هو من دراسة الاستجابة للجرح وإصلاحه.
Protocol
هذا البروتوكول هو مقتطف من شو وتشيشولم ، وأساليب الجرح الجلد والمقايسات للاستجابات الجرح في C. elegans، J. Vis. Exp. (2014).
1. الليزر الجرح
ملاحظة: استخدام أشعة الليزر femtosecond (800 نانومتر) لأداء الجرح أكثر دقة.
- إعداد منصات أجار على شريحة زجاجية مع ذاب 2٪ أجار. تأكد من منصات مماثلة لمنصات أجار المستخدمة للتصوير الحي من elegans C..
- نقل 10 الديدان الشباب الكبار على لوحة agarose مع اختيار دودة، وإضافة قطرة 2 ميكرولتر من محلول ليفاميسول 12 mM. تغطية الحيوانات والسائل مع زلة غطاء. انتظر 1-2 دقيقة للديدان لشل.
- ضع الشريحة الزجاجية على مجهر كونفوجال قرص الغزل. نقل المرحلة للعثور على الديدان والتركيز على البشرة الأمامية الجانبية أو الخلفية المتزامنة مع هدف 100X (NA 1.4-1.46).
- تعيين قوة ليزر femtosecond إلى 140 كيلوواط (تقاس قبل الهدف). استخدام الليزر femtosecond بمعدل تكرار 80 ميغاهرتز.
ملاحظة: نبضتان من 200 msec لكل منهما (مفصولة ب 20 msec) كافية للجرح في أيدينا. - التركيز على سطح apical من الخلية البشرة وجرح البشرة. لاحظ الاضطراب الموضعي للسيتوبلازم (محتدما) ، أو التبييض المحلي لأي علامة فلورية مستخدمة.
ملاحظة: اتبع إجراءات السلامة الليزر المناسبة عند استخدام الليزر femtosecond. يجب أن يوفر مسح الخط أو النقطة باستخدام أشعة الليزر الفيمتوثانية مثل تلك الموجودة في مجهرين فوتونين طاقة كافية للإصابة بالليزر.
ملاحظة: في حين أننا لا نملك خبرة مباشرة في استخدام أشعة الليزر الأخرى، من حيث المبدأ يجب أن يكون الجرح ممكنا باستخدام أشعة الليزر الأشعة فوق البنفسجية التقليدية (كما هو مستخدم في استئصال الخلايا C. elegans). اختياريا، استخدم وحدة استرداد الفلورية بعد Photobleaching (FRAP) على كونفوكوكال القرص الغزل لجرح البشرة (N. بوجول، الاتصالات الشخصية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
