Overview
Denne video introducerer en metode til laser sår, som bruges til at forårsage meget præcise skader i ormen epidermis. Prøveprotokollen er fra en undersøgelse af sårrespons og reparation.
Protocol
Denne protokol er et uddrag fra Xu og Chisholm, Metoder til hud sår og assays for sårresponser i C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).
1. Laser sår
BEMÆRK: Brug femtosekund laserbestråling (800 nm) til at udføre mere præcise sår.
- Forbered agar puder på et glas dias med smeltet 2% agar. Sørg for, at puderne ligner de agarpuder, der bruges til levende billeddannelse af C. elegans.
- Overfør 10 unge voksne orme på agarose pad med orm pick, og tilsæt en 2 μl dråbe 12 mM Levamisole opløsning. Dæk dyrene og væsken med en dæksedlen. Vent 1-2 minutter for ormene at lamme.
- Placer glasrutschebanen på et roterende disk confocal mikroskop. Flyt scenen for at finde ormene og fokuser på den laterale forreste eller bageste syncytial epidermis med et 100X mål (NA 1.4-1.46).
- Sæt effekt af femtosecond laser til 140 mW (målt før målet). Brug femtosekunders laser med en gentagelseshastighed på 80 MHz.
BEMÆRK: To impulser på 200 msec hver (adskilt af 20 msec) er tilstrækkelige til sår i vores hænder. - Fokuser på den apikale overflade af den epidermale celle og så epidermis. Overhold lokal forstyrrelse af cytoplasmaet (boblende) eller lokal blegning af enhver fluorescerende markør, der anvendes.
BEMÆRK: Følg passende lasersikkerhedsprocedurer, når du bruger femtosekundlaseren. Line eller punkt scanninger ved hjælp af femtosecond lasere som dem i to foton mikroskoper bør give tilstrækkelig effekt til laser sår.
BEMÆRK: Selv om vi ikke har direkte erfaring med at bruge andre lasere, i princippet sår bør være muligt ved hjælp af konventionelle UV-lasere (som anvendes i C. elegans celle ablations). Du kan også bruge et fluorescensgendannelsesmodul efter photobleaching (FRAP) på roterende disk confocal til at såre epidermis (N. Pujol, personlig kommunikation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
