Epidermale Laserverwundung: Induzieren lokalisierter Schäden zur Untersuchung von Reparaturprozessen in C. elegans

Overview

Dieses Video stellt eine Methode der Laserverwundung vor, die verwendet wird, um sehr präzise Verletzungen in der Wurmepidermis zu verursachen.  Das Probenprotokoll stammt aus einer Untersuchung des Wundanstichs und der Reparatur.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Xu und Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. (2014).

1. Laser-Wundung

HINWEIS: Verwenden Sie Femtosekunden-Laserbestrahlung (800 nm), um eine präzisere Wundung durchzuführen.

1. Bereiten Sie Agar-Pads auf einer Glasrutsche mit geschmolzenem 2% Agar vor. Stellen Sie sicher, dass die Pads den Agar-Pads ähneln, die für die Live-Bildgebung von C. elegansverwendet werden.
2. Übertragen Sie 10 junge erwachsene Würmer mit Wurmpick auf das Agarosepad, und fügen Sie einen Tropfen von 12 mM Levamisol hinzu. Bedecken Sie die Tiere und die Flüssigkeit mit einem Deckelschlupf. Warten Sie 1-2 min, bis die Würmer lähmen.
3. Legen Sie den Glasschlitten auf ein konfokales Mikroskop, das sich dreht. Bewegen Sie die Bühne, um die Würmer zu finden und konzentrieren Sie sich auf die seitliche vordere oder hintere synzytiale Epidermis mit einem 100X Objektiv (NA 1.4-1.46).
4. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 140 mW (gemessen vor dem Objektiv) ein. Verwenden Sie den Femtosekundenlaser mit einer Wiederholungsrate von 80 MHz.
   HINWEIS: Zwei Impulse von je 200 msec (getrennt durch 20 msec) reichen aus, um in unseren Händen zu wunden.
5. Konzentrieren Sie sich auf die apikale Oberfläche der epidermalen Zelle und wickeln Sie die Epidermis. Beobachten Sie lokale Störungen des Zytoplasmas (Bubbling) oder lokale Bleichen eines verwendeten Fluoreszenzmarkers.
   HINWEIS: Befolgen Sie die entsprechenden Lasersicherheitsverfahren, wenn Sie den Femtosekundenlaser verwenden. Linien- oder Punktscans mit Femtosekundenlasern, wie sie in zwei Photonenmikroskopen verwendet werden, sollten ausreichend Leistung für die Laserwundung bieten.
   HINWEIS: Obwohl wir keine direkte Erfahrung mit anderen Lasern haben, sollte im Prinzip Wundung mit herkömmlichen UV-Lasern (wie in C. elegans Zellablationen) möglich sein. Optional verwenden Sie ein Fluoreszenz-Recovery After Photobleaching (FRAP)-Modul auf spinnenden Scheiben konfokale, um die Epidermis zu wickeln (N. Pujol, persönliche Kommunikation).