Overview
이 비디오는 벌레 표피에서 매우 정확한 부상을 일으키는 데 사용되는 레이저 부상 방법을 소개합니다. 샘플 프로토콜은 상처 반응 및 수리에 대한 연구에서 나온 것입니다.
Protocol
이 프로토콜은 Xu와 치스홀름에서 발췌, C. elegans에서상처 응답에 대한 피부 상처 및 분석 방법,J. Vis. Exp. (2014).
1. 레이저 상처
참고: 펨토초 레이저 조사(800nm)를 사용하여 보다 정밀한 상처를 수행합니다.
- 녹은 2% 화루와 유리 슬라이드에 한천 패드를 준비합니다. 패드가 C. elegans의라이브 이미징에 사용되는 한천 패드와 유사한지 확인합니다.
- 10명의 젊은 성인 웜을 벌레 선택으로 아가로즈 패드에 옮기고 12m Levamisole 용액의 2 μl 방울을 추가합니다. 동물과 액체를 덮개 슬립으로 덮습니다. 벌레가 마비될 때까지 1-2분 기다립니다.
- 회전하는 디스크 공초점 현미경에 유리 슬라이드를 놓습니다. 스테이지를 이동하여 웜을 찾고 100X 목표(NA 1.4-1.46)를 사용하여 측면 전방 또는 후방 동기화 표피에 초점을 맞춥니다.
- 펨토초 레이저의 힘을 140mW로 설정합니다(목표 전에 측정). 80MHz의 반복 속도로 펨토초 레이저를 사용하십시오.
참고: 각각 200msec의 두 펄스 (20 msec로 분리)는 우리의 손에 상처를 입기에 충분합니다. - 표피 세포의 정표 표면에 초점을 맞추고 표피를 감습니다. 세포질 (버블링) 또는 사용되는 형광 마커의 국소 표백의 로컬 중단을 관찰하십시오.
참고: 펨토초 레이저를 사용할 때 적절한 레이저 안전 절차를 따르십시오. 두 개의 광자 현미경에 있는 것과 같은 펨토초 레이저를 사용하여 라인 또는 포인트 검사는 레이저 감기에 충분한 힘을 제공해야 합니다.
참고: 우리는 다른 레이저를 사용하는 직접적인 경험이 없지만 원칙적으로 상처는 기존의 UV 레이저 (C. elegans 세포 절제에 사용되는 대로)를 사용하여 가능해야합니다. 선택적으로, 표피 (N. Pujol, 개인 통신)를 상처 디스크 공초점에 광표백 (FRAP) 모듈 후 형광 복구를 사용합니다.
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