Overview
Denne videoen introduserer en metode for lasersår, som brukes til å forårsake svært presise skader i orm epidermis. Prøveprotokollen er fra en studie av sårrespons og reparasjon.
Protocol
Denne protokollen er et utdrag fra Xu og Chisholm, Metoder for hudsår og analyser for sårresponser i C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).
1. Lasersår
MERK: Bruk femtosecond laserbestråling (800 nm) for å utføre mer presis såring.
- Forbered agarputer på en glasssklie med smeltet 2% agar. Forsikre deg om at padsene ligner agarputene som brukes til levende bildebehandling av C. elegans.
- Overfør 10 unge voksne ormer på agaroseputen med ormplukk, og legg til en 2 μl dråpe 12 mM Levamisole-løsning. Dekk dyrene og væsken med en dekselslipp. Vent 1-2 min for ormene å lamme.
- Plasser glasssklie på et roterende diskkonfokalt mikroskop. Flytt scenen for å finne ormene og fokuser på lateral fremre eller bakre synytial epidermis med et 100X mål (NA 1.4-1.46).
- Sett kraften til femtosecond laseren til 140 mW (målt før målet). Bruk femtosecond laser med en repetisjonshastighet på 80 MHz.
MERK: To pulser på 200 msek hver (separert med 20 ms) er tilstrekkelig for såring i våre hender. - Fokuser på den apikale overflaten av epidermalcellen og sår epidermis. Vær oppmerksom på lokal forstyrrelse av cytoplasma (boblende), eller lokal bleking av fluorescerende markør som brukes.
MERK: Følg passende lasersikkerhetsprosedyrer når du bruker femtosecond-laseren. Linje- eller punktskanninger ved hjelp av femtosecond-lasere, for eksempel de i to fotonmikroskop, bør gi tilstrekkelig kraft til lasersår.
MERK: Selv om vi ikke har direkte erfaring med å bruke andre lasere, bør sår i prinsippet være mulig ved hjelp av konvensjonelle UV-lasere (som brukt i C. elegans celle ablations). Alternativt kan du bruke en Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)-modul på spinnende diskkonfokal for å såre epidermis (N. Pujol, personlig kommunikasjon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.