Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Epidermal lasersår: Indusere lokalisert skade for å undersøke reparasjonsprosesser i C. elegans

Overview

Denne videoen introduserer en metode for lasersår, som brukes til å forårsake svært presise skader i orm epidermis.  Prøveprotokollen er fra en studie av sårrespons og reparasjon.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Xu og Chisholm, Metoder for hudsår og analyser for sårresponser i C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Lasersår

MERK: Bruk femtosecond laserbestråling (800 nm) for å utføre mer presis såring.

  1. Forbered agarputer på en glasssklie med smeltet 2% agar. Forsikre deg om at padsene ligner agarputene som brukes til levende bildebehandling av C. elegans.
  2. Overfør 10 unge voksne ormer på agaroseputen med ormplukk, og legg til en 2 μl dråpe 12 mM Levamisole-løsning. Dekk dyrene og væsken med en dekselslipp. Vent 1-2 min for ormene å lamme.
  3. Plasser glasssklie på et roterende diskkonfokalt mikroskop. Flytt scenen for å finne ormene og fokuser på lateral fremre eller bakre synytial epidermis med et 100X mål (NA 1.4-1.46).
  4. Sett kraften til femtosecond laseren til 140 mW (målt før målet). Bruk femtosecond laser med en repetisjonshastighet på 80 MHz.
    MERK: To pulser på 200 msek hver (separert med 20 ms) er tilstrekkelig for såring i våre hender.
  5. Fokuser på den apikale overflaten av epidermalcellen og sår epidermis. Vær oppmerksom på lokal forstyrrelse av cytoplasma (boblende), eller lokal bleking av fluorescerende markør som brukes.
    MERK: Følg passende lasersikkerhetsprosedyrer når du bruker femtosecond-laseren. Linje- eller punktskanninger ved hjelp av femtosecond-lasere, for eksempel de i to fotonmikroskop, bør gi tilstrekkelig kraft til lasersår.
    MERK: Selv om vi ikke har direkte erfaring med å bruke andre lasere, bør sår i prinsippet være mulig ved hjelp av konvensjonelle UV-lasere (som brukt i C. elegans celle ablations). Alternativt kan du bruke en Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)-modul på spinnende diskkonfokal for å såre epidermis (N. Pujol, personlig kommunikasjon).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Tags

Tom verdi Problem
Epidermal lasersår: Indusere lokalisert skade for å undersøke reparasjonsprosesser i <em>C. elegans</em>
Play Video

Kilde: Xu, S. og Chisholm, A. D. Metoder for hudsår og analyser for sårresponser i C. elegans. J. Vis. Utt. (2014). 

View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter