Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Epidermal Lazer Yaralama: C. elegans'taki Onarım Süreçlerini İncelemek için Lokalize Hasara Neden Olma

Overview

Bu video, solucan epidermisinde çok hassas yaralanmalara neden olmak için kullanılan bir lazer yaralama yöntemini tanıtmaktadır.  Örnek protokol yara tepkisi ve onarımı çalışmasından.

Protocol

Bu protokol Xu ve Chisholm, Cilt Yarası Yöntemleri ve C. elegans, J. Vis.Exp'deki Yara Yanıtları için Tahlillerden bir alıntıdır. (2014).

1. Lazer Yaralama

NOT: Daha hassas yaralama yapmak için femtosaniye lazer ışınlama (800 nm) kullanın.

  1. Eritilmiş% 2 agar ile cam bir kaydırağa agar pedleri hazırlayın. Pedlerin C. eleganlarıncanlı görüntülenmesi için kullanılan agar pedlerine benzer olduğundan emin olun.
  2. 10 genç yetişkin solucanı solucan toplama ile agarose pad'e aktarın ve 12 mM Levamisole çözeltisinin 2 μl'lik bir damlasını ekleyin. Hayvanları ve sıvıyı bir kapak kayması ile örtün. Solucanların felç olmasını 1-2 dakika bekleyin.
  3. Cam slaydı dönen bir disk konfokal mikroskobun üzerine yerleştirin. Solucanları bulmak için sahneyi hareket ettinin ve 100X hedefiyle (NA 1.4-1.46) yanal ön veya arka senksiyal epidermisine odaklanın.
  4. Femtosaniye lazerin gücünü 140 mW'a ayarlayın (amaç öncesinde ölçülür). Femtosaniye lazeri 80 MHz tekrarlama hızında kullanın.
    NOT: Her biri 200 milislik iki darbe (20 msec ile ayrılmıştır) elimizdeki yara için yeterlidir.
  5. Epidermal hücrenin apikal yüzeyine odaklanın ve epidermisi yaralayın. Sitoplazmanın lokal bozulmasını (köpürme) veya kullanılan herhangi bir floresan işaretleyicinin lokal ağartma gözlemleyin.
    NOT: Femtosaniye lazeri kullanırken uygun lazer güvenlik prosedürlerini izleyin. İki foton mikroskoptakiler gibi femtosaniye lazerler kullanılarak yapılan hat veya nokta taramaları lazer yaralama için yeterli güç sağlamalıdır.
    NOT: Diğer lazerleri kullanma konusunda doğrudan deneyimimiz olmasa da, prensipte geleneksel UV lazerler kullanılarak (C. elegans hücre ablasyonlarında kullanıldığı gibi) yaralama mümkün olmalıdır. İsteğe bağlı olarak, epidermisi (N. Pujol, kişisel iletişim) yaralamak için dönen disk konfokal üzerinde Fotobleaching Sonrası Floresan Kurtarma (FRAP) modülü kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Tags

Boş Değer Sorun
Epidermal Lazer Yaralama: <em>C. elegans'taki</em> Onarım Süreçlerini İncelemek için Lokalize Hasara Neden Olma
Play Video

Kaynak: Xu, S. ve Chisholm, A. D. C. elegans'taCilt Yarası ve Yara Yanıtları için Tahlil Yöntemleri . J. Vis. Exp. (2014). 

View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter