FITC-德克斯特兰喂养：量化C.elegans肠道渗透性的方法

Overview

该视频引入了一种方法，通过喂养含有 FITC 标签的 dextran 蠕虫来可视化和测量 C. elegans 肠流明的完整性。 示例协议显示了用 3，3'-丁二甲烷 （DIM） 处理和病原体喂养的蠕虫进行的检测。

Protocol

本协议是勒等人的摘录，衡量细菌和化学物质对肠渗透性的影响，卡诺哈布迪炎，J.Vis.Exp。(2019).

1. 准备NGM板测试化学品（DIM）对C.埃莱甘斯美联储肠道渗透性的影响与P.阿鲁吉诺萨
   1. 在 500 毫升玻璃瓶 （NGM agar） 中加入 0.5 克 pepton、0.6 克 NaCl、195 毫升蒸馏水、磁搅拌器和 6.8 克 agar。
   2. 加入 0.5 克 peptone、0.6 克 NaCl、195 毫升蒸馏水和无阿加的磁搅拌器到另一个 500 毫升玻璃瓶 （NGM 肉汤）中。
   3. 自动将两个瓶子（从步骤 1.1+1.2 起）、一个空的 100 毫升玻璃瓶和一个空的 500 毫升玻璃瓶在 121 °C 下 15 分钟。 然后，让装有瓶子的介质在水浴中冷却至 55 °C 30 分钟。将 agar 介质保存在水浴中，并取出含有汤的瓶子（从步骤 1.2 开始），以进行下一步。
   4. 将添加剂化学物质添加到 NGM 汤中：0.4 mL 的 1 M CaCl₂、0.4 mL 乙醇中的胆固醇 （mL）、0.4 mL 的 1 MgSO₄和 10 mL 的 1 M KPO_4（所有这些组件必须除乙醇中的胆固醇外进行灭菌）。然后，在 55 °C 时用磁搅拌器彻底搅拌混合物。
   5. 将自动切割的空 500 毫升玻璃瓶与二甲基硫氧化物 （DMSO） 和带 DIM 的自动切割的空 100 mL 玻璃瓶贴上标签。
   6. 将 50 mL 的 NGM 汤转移到 DIM 标记的 100 mL 瓶中。将 500 μL 的 20 mM DIM 库存添加到瓶子中，并混合均好。
      注：DIM 溶于 DMSO（20 mM DIM 库存）。
   7. 快速从水浴中取出 NGM agar 介质，将 50 mL 的 NGM agar 介质添加到 DIM 标记的瓶子中，然后彻底混合。
   8. 将含有 DIM 的 NGM 介质的 20 mL 别名放入每个 90 mm x 15 mm 培养皿中。大约五个含DIM的NGM板可以从这一步骤。
      注：每个 NGM 板中的 DIM 最终浓度为 100 μM。
   9. 要准备含 DMSO 的 NGM 板，请将 150 mL 的 NGM 汤转移到 DMSO 标记的 500 mL 瓶中。将 1.5 mL 的 DMSO 添加到瓶子中并混合均好。
   10. 将 150 mL 的 NGM agar 介质添加到 DMSO 标记的瓶子中，然后彻底混合。
   11. 在每道90毫米×15毫米的培养皿中放置一个含有DMSO的NGM介质的20mL别名。大约15个含DMSO的NGM板可以从这一步骤。
       注：每个 NGM 板块中 DMSO 的最终浓度为 0.5%。
   12. 在室温下将盘子凝固至少3小时，并将它们存放在4°C，直到使用。
       注：协议可在此处暂停。
   13. 从 4 °C 冰箱中取出大肠杆菌OP50 或P. aeruginosa PAO1 培养，在扩散到 NGM 板上之前，将培养基正确漩涡。
   14. 将大肠杆菌OP50 或P. aeruginosa PAO1 细菌培养的 800 μL 放入每个新鲜的 NGM agar 板上，让板在 20 °C 的孵化器中干燥过夜。
       注：协议可在此处暂停。在第三个实验（图1）中，准备了两个含有DMSO的NGM板，上面涂有活大肠杆菌OP50，一个含有DMSO的NGM板涂有活的P.aeruginosa PAO1，以及一个含DIM的NGM板，上面涂有活的P.aeruginosa PAO1。
2. 细菌或DIIM和FITC-德克斯特兰喂养的治疗
   1. 在 NGM 板上以 20 °C 的 64 小时孵育年龄同步鸡蛋，并辅以活大肠杆菌OP50 作为食物。
   2. 用 S 缓冲器清洗年龄同步的 L4 幼虫，并将它们（约 500 多种蠕虫）转移到含有不同细菌和化学物质的治疗 NGM 板中。在20°C下孵育48小时。
      注：根据所使用的细菌和化学物质，治疗时间从24小时到72小时不等。DIM 的治疗或预防效果也可以通过用病原体预处理蠕虫，然后用 DIM（治疗效果）治疗蠕虫，或者用 DIM 预处理蠕虫，然后用病原体治疗（预防效果）来评估。
   3. 要准备 FITC-德克斯特伦补充板，将 2 mL 的热灭活大肠杆菌OP50 与 4 毫克 FITC-德克斯特伦混合。然后，将 FITC-dextran 和大肠杆菌OP50 混合物的 100 μL 分成 20 个新鲜的 NGM agar 板（60 mm x 15 mm），让板在干净的长凳上干燥 1 小时。
      注：FITC-德克斯特伦在每个NGM板的最终浓度为20微克/mL。
   4. 准备五个含大肠杆菌OP50 的 NGM 板，无需 FITC-德克斯特伦进行车辆控制处理。为此，将 100 μL 热灭活大肠杆菌OP50 划分到每个新鲜的 NGM agar 板（60 mm x 15 mm），并让板在干净的长凳上干燥 1 小时。
      注：对于每个独立的实验，需要15个FITC-德克斯特兰补充的NGM板和5个没有FITC-德克斯特伦的NGM板。
   5. 经过 48 小时的治疗（从步骤 2.2 开始），用 S 缓冲器清洗蠕虫，将蠕虫转移到 FITC-dextran 补充板和无 FITC-dextran 的 NGM 板，并在夜间（14-15 h）孵化板。
      注：对于每个治疗组，需要 5 个 FITC-德克斯特伦染色（或车辆控制喂养）的复制品。
   6. 用 S 缓冲器清洗蠕虫，并允许它们在新的 NGM agar 板中爬行 1 小时。
      注：对于每个独立的实验，总共需要 20 个新鲜的 NGM 板。在此步骤中，您可以使用无大肠杆菌OP50 补充的 NGM 板。
   7. 在黑色 96 井平底板的每口井中加入 50μL 的 4% 甲醛溶液。将大约 50 种蠕虫从每个 NGM 板转移到每个井中，用于荧光测量。1 至 2 分钟后，彻底去除每口井中的所有甲醛，并加入 100 μL 的安装介质涂抹油井。
      注：甲醛溶液 （4%）用于固定和修复蠕虫。对于每个治疗组，5口井（5个复制品）用于图像分析。
3. 通过测量 FITC-dextran 荧光吸收，使用奥佩雷塔成像系统成像C. elegans和确定肠道渗透性
   注：荧光立体镜检查可用于图像分析，而不是奥佩雷塔系统。
   1. 使用 Operetta 高含量成像系统捕获荧光图像并测量荧光强度，并使用 Harmony 软件分析图像。
   2. 在 Harmony 软件中，按下图标打开盖子并将板放入机器中。
   3. 设置参数。
   4. 单击设置，选择板型（96 井玉米平底），并添加通道（光明场和EGFP通道）。
   5. 调整布局。转到布局选择，然后选择"跟踪"并调整参数（第一张图片为 1 μm，平面数量为 10，距离为 1 μm）。
   6. 选择一个处理井和一个捕获场和按测试，以检查图片是否令人满意的运行实验部分。
   7. 如果图片令人满意，请返回设置部分，并在屏幕末尾按重置图标。然后，选择所有目标井和适量的捕获字段。
   8. 再次转到运行实验并输入板名，然后按"开始"开始处理。
   9. 要测量荧光的强度，转到图像分析部分并输入图像。通过选择EGFP通道和方法B找到细胞。 将通用阈值调整为0.5，区域调整为 >200 μm^2，拆分因子调整为3.0，单个阈值调整为0.18，对比度超过0.18。然后，计算强度属性并选择均值作为输出。按应用图标以保存设置。
   10. 转到评估部分，通过获取热图和数据表来测量强度。将读出参数设置为单元格——强度细胞EGFP均值——均值每井并开始评估。
       注：协议可在此处暂停。
   11. 要从 Operetta 提取数据，请单击"设置"按钮并选择数据管理。
   12. 选择"写"存档，然后打开浏览并选择文件。
   13. 要选择文件，请单击左角的小+信号，然后单击"测量"并选择板名。
   14. 选择文件并单击"确定"。
   15. 通过单击活动路径上的浏览信号来选择保存文件的路径。
   16. 单击"开始"以保存数据文件。
       注：协议可在此处暂停。
4. C. elegans的 FITC-德克斯特兰荧光统计分析
   1. 导入数据并使用统计软件计算平均值和标准偏差 （SD）。
   2. 通过对方差 （ANOVA） 的单向分析分析显著差异，然后进行 Tukey 的多重比较测试。

Representative Results

图1：DIM对C.elegans喂养P.阿鲁吉诺萨的肠道渗透性的影响。来自（A）大肠杆菌OP50 的蠕虫的显微镜图像，没有 FITC-dextran 喂养，（B）大肠杆菌与 FITC-德克斯特兰喂养，（C） Aeruginosa PAO1 与 FITC-德克斯特兰喂养，以及（D） P. 阿鲁吉诺萨和 DIM （100 μM） 与 FITC-德克斯特兰喂养的共处理。比例杆 = 1 毫米（白色）和 200μm（黑色）。年龄同步的L4幼虫在NGM板中孵育48小时，播种有活大肠杆菌（A，B），活的P.阿鲁吉诺萨（C），活的P.阿鲁吉诺萨和DIM（D）。然后，蠕虫被转移到含有FITC-德克斯特兰（B-D）的板，除了车辆控制（A）。（E） FITC 荧光强度表示C. elegans的肠道渗透性受到 DIM 的影响。列和错误栏表示与车辆控制有显著差异的平均± SD. ***P & 0.001。###P&0.001和##P&0.01与用P.阿鲁吉诺萨PAO1（ANOVA，n = 5）喂养的FITC-德克斯特兰处理的蠕虫有显著差异。 此图代表两个独立实验。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N