FITC-Dextran Feeding: En metode til at kvantificere tarmpermeabilitet i C. elegans

Overview

Denne video introducerer en metode til at visualisere og måle integriteten af C. elegans tarm lumen ved fodring orme FITC-mærket dextran.  Eksempelprotokollen viser analysen udført med 3,3'-diindolylmethan (DIM)-behandlede og patogenfodrede orme.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Le et al, Måling af virkningerne af bakterier og kemikalier på tarm permeabilitet caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Forberedelse af NGM Plader til test af virkningerne af et kemikalie (DIM) på tarmgennemtrængeligheden af C. elegans Fed med P. aeruginosa
   1. Der tilsættes 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL destilleret vand, en magnetisk omrører og 6,8 g agar til en 500 mL glasflaske (NGM agar).
   2. Der tilsættes 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL destilleret vand og en magnetisk omrører uden agar til en anden 500 mL glasflaske (NGM bouillon).
   3. Autoklave de to flasker (fra trin 1.1-1.2), en tom 100 mL glasflaske og en tom 500 mL glasflaske i 15 min ved 121 °C. Lad derefter mediet indeholdende flasker køle af til 55 °C i vandbadet i 30 minutter. Hold agarmediet i vandbadet og fjern flasken med bouillon (fra trin 1.2) til næste trin.
   4. Tilsæt tilsætningsstofkemikalier til NGM bouillon: 0,4 mL 1 M CaCl₂, 0,4 mL kolesterol i ethanol (mL), 0,4 mL på 1 M MgSO₄ og 10 mL 1 M KPO₄ (alle disse komponenter skal steriliseres bortset fra kolesterol i ethanol). Derefter omrøres blandingen grundigt med en magnetisk omrører ved 55 °C.
   5. Mærk den autoklaverede tomme 500 mL glasflaske med dimethylsulfoxid (DMSO) og den autoklaverede tomme 100 mL glasflaske med DIM.
   6. Der overføres 50 mL NGM bouillon til den DIM-mærkede 100 mL flaske. Tilsæt 500 μL 20 mM DIM-lager i flasken og bland godt.
      BEMÆRK: DIM opløses i DMSO (20 mM DIM-lager).
   7. Fjern hurtigt NGM agar-mediet fra vandbadet, tilsæt 50 mL af NGM agar-mediet i den DIM-mærkede flaske og bland grundigt.
   8. Der anbringes et 20 mL aliquot af DIM-holdige NGM-medium i hver 90 mm x 15 mm petriskål. Der kan laves ca. fem DIM-holdige NGM-plader fra dette trin.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af DIM i hver NGM plade vil være 100 μM.
   9. For at forberede den DMSO-holdige NGM-plade overføres 150 mL NGM bouillon til dmso-mærket 500 mL flaske. Tilsæt 1,5 mL DMSO til flasken og bland godt.
   10. Tilsæt 150 mL af NGM agar-mediet til den DMSO-mærkede flaske og bland grundigt.
   11. Der anbringes en 20 mL prøve af DMSO-holdige NGM-medium i hver 90 mm x 15 mm petriskål. Der kan laves ca. 15 DMSO-holdige NGM-plader fra dette trin.
       BEMÆRK: Den endelige koncentration af DMSO i hver NGM plade vil være 0,5%.
   12. Pladerne størknes ved stuetemperatur i mindst 3 timer, og de opbevares ved 4 °C, indtil de anvendes.
       BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
   13. E. coli OP50- eller P. aeruginosa PAO1-kulturen tages ud af køleskabet på 4 °C, og kulturen hvirvles korrekt, inden den spredes på NGM-pladerne.
   14. Der anbringes 800 μL af bakteriekulturen E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 på hver frisk NGM agarplade, og pladerne tørres i en 20 °C inkubator natten over.
       BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Til det tredje forsøg (figur 1) blev der fremstillet to DMSO-holdige NGM-plader belagt med levende E. coli OP50, en DMSO-holdige NGM-plade belagt med levende P. aeruginosa PAO1 og en DIM-indeholdende NGM-plade belagt med levende P. aeruginosa PAO1.
2. Behandling af bakterier eller DIM og FITC-dextran Fodring
   1. De alderssynkronerede æg inkuberes ved 20 °C i 64 timer på NGM-plader suppleret med levende E. coli OP50 som fødevarer.
   2. Vask den alderssynkronerede L4 larve med S-buffer og overfør dem (mere end ca. 500 orme) til behandlings-NGM-plader, der indeholder forskellige bakterier og kemikalier. Inkuber dem ved 20 °C i 48 timer.
      BEMÆRK: Behandlingstiden kan variere fra 24 til 72 timer, ifølge de anvendte bakterier og kemikalier. Den terapeutiske eller forebyggende effekt af DIM kan også evalueres ved at forbehandle ormene med patogener og derefter behandle ormene med DIM (den terapeutiske effekt) eller ved at forbehandle ormene med DIM og derefter behandle med patogener (den forebyggende effekt).
   3. For at forberede de FITC-dextran-supplerede plader blandes 2 mL varmeinaktiveret E. coli OP50 med 4 mg FITC-dextran. Derefter opdeles 100 μL af FITC-dextran- og E. coli OP50-blandingen i tyve friske NGM-agarplader (60 mm x 15 mm), og pladerne tørres i 1 time på en ren bænk.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af FITC-dextran i hver NGM-plade vil være 20 μg/mL.
   4. Forbered fem E. coli OP50-holdige NGM-plader uden FITC-dextran til køretøjets kontrolbehandling. Til dette formål opdeles 100 μL varmeinaktiveret E. coli OP50 til hver friske NGM agar plader (60 mm x 15 mm) og lad pladerne tørre i 1 time på en ren bænk.
      BEMÆRK: For hvert uafhængigt eksperiment kræves femten FITC-dextran-supplerede NGM-plader og fem NGM-plader uden FITC-dextran.
   5. Efter 48 timers behandling (fra trin 2.2) skal ormene vaskes med S-buffer, ormene overføres til FITC-dextran-supplerede plader og NGM-pladerne uden FITC-dextran og inkubere pladerne natten over (14-15 timer).
      BEMÆRK: For hver behandlingsgruppe kræves 5 replikater af FITC-dextran farvning (eller køretøjskontrol fodring).
   6. Vask ormene med S-buffer og lad dem kravle i den friske NGM agar plade i 1 time.
      BEMÆRK: For hvert uafhængigt eksperiment er der brug for i alt 20 friske NGM-plader. I dette trin kan du bruge NGM-pladen suppleret uden eller med E. coli OP50.
   7. Der tilsættes 50 μL 4% formaldehydopløsning til hver brønd af en sort 96-brønds fladbundet plade. Overfør ca. 50 orme fra hver NGM-plade til hver brønd til fluorescensmålinger. Efter 1 til 2 min fjernes al formaldehyd grundigt fra hver brønd og tilsættes 100 μL monteringsmedium for at belægge brøndene.
      BEMÆRK: Formaldehydopløsning (4%) bruges til at immobilisere og rette ormene. For hver behandlingsgruppe anvendes 5 brønde (5 replikater) til billedanalyse.
3. Imaging C. elegans med Opeetta Imaging System og bestemmelse af tarmgennemtrængelighed ved at måle FITC-dextran Fluorescens Optagelse
   BEMÆRK: Fluorescerende stereomikroskopi kan bruges til billedanalyse i stedet for Operetta-systemet.
   1. Tag fluorescensbilleder, og mål fluorescensintensiteten ved hjælp af Opeetta High-Content Imaging System, og analysér billederne med Harmony-software.
   2. Tryk på ikonet Åbn låg i Harmony-softwaren for at åbne låget og lægge pladen i maskinen.
   3. Konfigurer parametrene.
   4. Klik på Konfigurer, vælg pladetypen (96-brønds corning flat-bottom), og tilføj kanalerne (lyse felt- og EGFP-kanaler).
   5. Juster layoutet. Gå til valg af layout, og vælg derefter Spor og juster parametrene (første billede ved 1 μm, antallet af planer er 10, afstanden er 1 μm).
   6. Vælg en af behandlingsbrøndene og et indfangningsfelt, og tryk på Test for at kontrollere, om billederne er tilfredsstillende i afsnittet Kør eksperiment.
   7. Hvis billederne er tilfredsstillende, skal du vende tilbage til afsnittet Konfigurer og trykke på ikonet Nulstil i slutningen af skærmen. Vælg derefter alle målbrøndene og et passende antal erobringsfelter.
   8. Gå til Kør eksperiment igen, og angiv pladenavnet, og tryk derefter på Start for at starte behandlingen.
   9. Hvis du vil måle intensiteten af fluorescensen, skal du gå til billedanalysesektionen og indtaste billedet. Find cellen ved at vælge EGFP-kanalen og metode B. Juster den fælles tærskel til 0,5, areal til >200 μm², opdelt faktor til 3,0, individuel tærskel til 0,18 og kontrast til mere end 0,18. Beregn derefter intensitetsegenskaberne, og vælg middelværdien som output. Tryk på ikonet Anvend for at gemme installationsprogrammet.
   10. Gå til evalueringsafsnittet for at måle intensiteten ved at få et varmekort og en datatabel. Angiv udlæsningsparameteren til Celler – Intensitetscelle-EGFP-middelværdi – Middelværdi pr. brønd, og start evalueringen.
       BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
   11. Hvis du vil udtrække dataene fra Operette, skal du klikke på knappen Indstilling og vælge Datastyring.
   12. Vælg Skriv arkiv, og åbn derefter gennemsynet, og vælg filen.
   13. Hvis du vil markere filen, skal du klikke på det lille + signal i venstre hjørne og derefter klikke på Måling og vælge Pladenavn.
   14. Marker filen , og klik på OK.
   15. Vælg den sti, hvor filen skal gemmes, ved at klikke på browsesignalet på den aktive sti.
   16. Klik på Start for at gemme datafilen.
       BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
4. Statistisk analyse af C. elegans FITC-dextran Fluorescens
   1. Importér dataene, og beregn middel- og standardafvigelsen (SD) ved hjælp af en statistiksoftware.
   2. Analyser den signifikante forskel med envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest.

Representative Results

Figur 1: Dim's indvirkning på tarmpermeabiliteten af C. elegans fodret P. aeruginosa. Mikroskopibilleder af orme fra (A) E. coli OP50 uden FITC-dextranfodring, (B) E. coli med FITC-dextranfodring, (C) P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextranfodring og (D) P. aeruginosa og DIM (100 μM) cotreatment med FITC-dextranfodring. Skalastang = 1 mm (hvid) og 200 μm (sort). Alderssynkronerede L4 larver blev inkuberet i 48 timer i NGM plader seedet med levende E. coli (A, B), levende P. aeruginosa (C), levende P. aeruginosa og DIM (D). Derefter blev ormene overført til plader, der indeholder FITC-dextran (B-D), bortset fra køretøjets kontrol (A). (E) FITC-lysstofintensiteten angiver, at C. elegans tarmgennemtrængelighed blev påvirket af DIM. Kolonner og fejllinjer angiver gennemsnittet ± SD. ***P < 0,001 for væsentlig forskel fra køretøjets kontrol. ^###P < 0,001 og ^##P < 0,01 for betydelig forskel fra fitc-dextran-behandlede orme fodret med P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Denne graf er repræsentativ for to uafhængige eksperimenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N