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Encyclopedia of Experiments

FITC-Dextran Feeding: Eine Methode zur Quantifizierung der Darmdurchlässigkeit in C. elegans

Overview

Dieses Video stellt eine Methode zur Visualisierung und Messung der Integrität des C. elegans Darmlumendurchfütterer durch Fütterung von Würmern mit FITC-beschrifteter Dextran vor.  Das Beispielprotokoll zeigt den Assay mit 3,3'-Diindolylmethan (DIM)-behandelten und pathogen gefütterten Würmern.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Le et al, Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

  1. Herstellung von NGM-Platten zur Prüfung der Auswirkungen einer Chemikalie (DIM) auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans Fed mit P. aeruginosa
    1. 0,5 g Pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml destilliertes Wasser, einen Magnetrührer und 6,8 g Agar zu einer 500 ml Glasflasche (NGM-Agar) geben.
    2. 0,5 g Pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml destilliertes Wasser und einen Magnetrührer ohne Agar zu einer weiteren 500 ml Glasflasche (NGM-Brühe) geben.
    3. Autoklavieren Sie die beiden Flaschen (von den Schritten 1.1–1.2), eine leere 100 ml Glasflasche und eine leere 500 ml Glasflasche für 15 min bei 121 °C. Dann lassen Sie das Medium, das Flaschen enthält, im Wasserbad 30 min auf 55 °C abkühlen. Bewahren Sie das Agarmedium im Wasserbad auf und entfernen Sie die mit Brühe (ab Schritt 1.2) enthaltende Flasche für den nächsten Schritt.
    4. Fügen Sie die Zusatzchemikalien in die NGM-Brühe: 0,4 ml von 1 M CaCl2, 0,4 ml Cholesterin in Ethanol (ml), 0,4 ml von 1 M MgSO4 und 10 ml von 1 M KPO4 hinzu (alle diese Komponenten müssen außer dem Cholesterin in Ethanol sterilisiert werden). Anschließend die Mischung bei 55 °C mit einem Magnetrührer gründlich rühren.
    5. Beschriften Sie die autoklavierte leere 500 ml Glasflasche mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und die autoklavierte leere 100 ml Glasflasche mit DIM.
    6. 50 ml NGM-Brühe in die DIM-etikettierte 100 ml Flasche geben. 500 l dIM 20 mM DIM-Lager in die Flasche geben und gut vermischen.
      HINWEIS: DIM wird in DMSO (20 mM DIM-Lager) aufgelöst.
    7. Das NGM-Agarmedium schnell aus dem Wasserbad nehmen, 50 ml des NGM Agarmediums in die DIM-markierte Flasche geben und gründlich vermischen.
    8. Legen Sie eine 20 ml Aliquot DIM-haltigen NGM-Medium in jede 90 mm x 15 mm Petrischale. Aus diesem Schritt können etwa fünf DIM-haltige NGM-Platten hergestellt werden.
      HINWEIS: Die Endkonzentration von DIM in jeder NGM-Platte beträgt 100 m.
    9. Zur Herstellung des DMSO-haltigen NGM-Tellers 150 ml NGM-Brühe in die DMSO-etikettierte 500 ml-Flasche geben. 1,5 ml DMSO in die Flasche geben und gut vermischen.
    10. 150 ml des NGM Agarmediums in die DMSO-etikettierte Flasche geben und gründlich vermischen.
    11. Legen Sie ein 20 ml Aliquot DMSO-haltiges NGM-Medium in jede 90 mm x 15 mm Petrischale. Aus diesem Schritt können etwa fünfzehn DMSO-haltige NGM-Platten hergestellt werden.
      HINWEIS: Die Endkonzentration von DMSO in jeder NGM-Platte beträgt 0,5%.
    12. Erstarren Sie die Platten bei Raumtemperatur mindestens 3 h und lagern Sie sie bei 4 °C bis zum Gebrauch.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
    13. Entfernen Sie die E. coli OP50 oder P. aeruginosa PAO1 Kultur aus dem 4 °C Kühlschrank und wirbeln Sie die Kultur richtig aus, bevor Sie sich auf die NGM-Platten ausbreiten.
    14. 800 L der E. coli OP50 oder P. aeruginosa PAO1-Bakterienkultur auf jede frische NGM-Agarplatte geben und die Platten über Nacht in einem 20 °C-Inkubator trocknen lassen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Für das dritte Experiment (Abbildung 1) wurden zwei DMSO-haltige NGM-Platten mit lebendem E. coli OP50, eine DMSO-haltige NGM-Platte, die mit lebendem P. aeruginosa PAO1 beschichtet ist, und eine DIM-haltige NGM-Platte mit lebendem P. aeruginosa PAO1 hergestellt.
  2. Behandlung von Bakterien oder DIM- und FITC-Dextran-Fütterung
    1. Die alterssynchronisierten Eier bei 20 °C für 64 h auf NGM-Platten, ergänzt mit lebendem E. coli OP50, als Nahrung inkubieren.
    2. Waschen Sie die alterssynchronisierte L4-Larve mit S-Puffer und übertragen Sie sie (mehr als ca. 500 Würmer) auf die Behandlung von NGM-Platten, die verschiedene Bakterien und Chemikalien enthalten. Inkubieren Sie sie bei 20 °C für 48 h.
      HINWEIS: Die Behandlungszeit kann von 24 bis 72 h, je nach den verwendeten Bakterien und Chemikalien. Die therapeutische oder präventive Wirkung von DIM kann auch bewertet werden, indem die Würmer mit Krankheitserregern vorbehandelt und dann die Würmer mit DIM (die therapeutische Wirkung) behandelt oder die Würmer mit DIM vorbehandelt und dann mit Krankheitserregern behandelt werden (die präventive Wirkung).
    3. Zur Herstellung der FITC-dextran-ergänzten Platten 2 ml wärmeinaktivierte E. coli OP50 mit 4 mg FITC-Dextran mischen. Dann 100 l des Gemischs FITC-dextran und E. coli OP50 in zwanzig frische NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm) aufteilen und die Platten auf einer sauberen Bank 1 h trocknen lassen.
      HINWEIS: Die Endkonzentration von FITC-Dextran in jeder NGM-Platte beträgt 20 g/ml.
    4. Bereiten Sie fünf E. coli OP50-haltige NGM-Platten ohne FITC-Dextran für die Fahrzeugsteuerungsbehandlung vor. Zu diesem Zweck 100 l wärmeaktivierte E. coli OP50 auf jede frische NGM Agarplatten (60 mm x 15 mm) aufteilen und die Platten auf einer sauberen Bank 1 h trocknen lassen.
      HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment werden 15 FITC-dextran-ergänzte NGM-Platten und fünf NGM-Platten ohne FITC-Dextran benötigt.
    5. Nach 48 h Behandlung (ab Schritt 2.2) die Würmer mit S-Puffer waschen, die Würmer ohne FITC-Dextran auf die FITC-dextran-ergänzten Platten und die NGM-Platten übertragen und die Platten über Nacht (14-15 h) inkubieren.
      HINWEIS: Für jede Behandlungsgruppe sind 5 Nachbildungen der FITC-Dextran-Färbung (oder Fahrzeugsteuerungszuführung) erforderlich.
    6. Waschen Sie die Würmer mit S-Puffer und lassen Sie sie in der frischen NGM AgarPlatte für 1 h kriechen.
      HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment werden insgesamt 20 frische NGM-Platten benötigt. In diesem Schritt können Sie die NGM-Platte ohne oder mit E. coli OP50 ergänzen.
    7. Fügen Sie jedem Brunnen einer schwarzen 96-Well-Flachbodenplatte 50 l 4% Formaldehydlösung hinzu. Übertragen Sie etwa 50 Würmer von jeder NGM-Platte in jeden Brunnen für Fluoreszenzmessungen. Nach 1 bis 2 min, gründlich entfernen Sie das gesamte Formaldehyd aus jedem Brunnen und fügen Sie 100 l Montagemedium, um die Brunnen zu beschichten.
      HINWEIS: Formaldehydlösung (4%) wird verwendet, um die Würmer zu immobilisieren und zu fixieren. Für jede Behandlungsgruppe werden 5 Brunnen (5 Replikationen) für die Bildanalyse verwendet.
  3. Imaging C. elegans mit dem Operetten-Bildgebungssystem und Bestimmung der Darmdurchlässigkeit durch Messung der FITC-dextran Fluoreszenzaufnahme
    HINWEIS: Die fluoreszierende Stereomikroskopie kann anstelle des Operettensystems für die Bildanalyse verwendet werden.
    1. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit dem Opetta High-Content Imaging System und analysieren Sie die Bilder mit der Harmony-Software.
    2. Drücken Sie in der Harmony-Software das Symbol Deckel öffnen, um den Deckel zu öffnen und die Platte in die Maschine zu legen.
    3. Richten Sie die Parameter ein.
    4. Klicken Sie auf Einrichten, wählen Sie den Plattentyp (96-well corning flat-bottom) und fügen Sie die Kanäle (Hellfeld- und EGFP-Kanäle) hinzu.
    5. Passen Sie das Layout an. Wechseln Sie zur Layoutauswahl, und wählen Sie dann Spur und passen Sie die Parameter an (erstes Bild bei 1 m, Anzahl der Ebenen sind 10, Abstand 1 m).
    6. Wählen Sie eine der Behandlungsbrunnen und ein Aufnahmefeld aus, und drücken Sie Test, um zu überprüfen, ob die Bilder im Abschnitt Ausführen von Experimenten zufriedenstellend sind.
    7. Wenn die Bilder zufriedenstellend sind, kehren Sie zum Abschnitt Einrichten zurück, und drücken Sie das Symbol Zurücksetzen am Ende des Bildschirms. Wählen Sie dann alle Zielbrunnen und eine geeignete Anzahl von Erfassungsfeldern aus.
    8. Gehen Sie erneut zu Experiment ausführen und geben Sie den Plattennamen ein, und drücken Sie dann Start, um mit der Verarbeitung zu beginnen.
    9. Um die Intensität der Fluoreszenz zu messen, gehen Sie zum Abschnitt Bildanalyse und geben Sie das Bild ein. Finden Sie die Zelle, indem Sie den EGFP-Kanal und die Methode B wählen. Passen Sie den gemeinsamen Schwellenwert auf 0,5, Fläche auf >200 m2,Split-Faktor auf 3,0, einzelbelagigen Schwellenwert auf 0,18 und Kontrast zu mehr als 0,18 an. Berechnen Sie dann die Intensitätseigenschaften, und wählen Sie den Mittelwert als Ausgabe aus. Drücken Sie das Symbol Anwenden, um das Setup zu speichern.
    10. Wechseln Sie zum Abschnitt Auswertung, um die Intensität zu messen, indem Sie eine Heatmap- und Datentabelle abrufen. Legen Sie den Parameter Auslesewert auf Zellen – Intensitätszelle EGFP-Mittelwert – Mittelwert pro Brunnen fest, und starten Sie die Auswertung.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
    11. Um die Daten aus der Operette zu extrahieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellen und wählen Sie Datenverwaltung.
    12. Wählen Sie Archiv schreiben, und öffnen Sie dann den Durchsuchen, und wählen Sie die Datei aus.
    13. Um die Datei auszuwählen, klicken Sie auf das kleine + Signal in der linken Ecke, und klicken Sie dann auf Messen und wählen Sie Plattenname.
    14. Wählen Sie die Datei aus, und klicken Sie auf OK.
    15. Wählen Sie den Pfad zum Speichern der Datei aus, indem Sie auf das Suchsignal am aktiven Pfad klicken.
    16. Klicken Sie auf Start, um die Datendatei zu speichern.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  4. Statistische Analyse der FITC-dextran Fluoreszenz von C. elegans
    1. Importieren Sie die Daten und berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) mit einer Statistiksoftware.
    2. Analysieren Sie den signifikanten Unterschied bei der einwegigen Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest.

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Representative Results

Figure 1
Abbildung 1: Die Wirkung von DIM auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans gefüttert P. aeruginosa. Mikroskopiebilder von Würmern aus (A) E. coli OP50 ohne FITC-dextran Fütterung, (B) E. coli mit FITC-dextran Fütterung, (C) P. aeruginosa PAO1 mit FITC-dextran Fütterung, und (D) P. aeruginosa und DIM (100 'M) Cotreatment mit FITC-dextran Fütterung. Skalenstange = 1 mm (weiß) und 200 m (schwarz). Alterssynchrone L4-Larven wurden für 48 h in NGM-Platten mit lebenden E. coli (A, B), live P. aeruginosa (C), live P. aeruginosa und DIM (D) bebrütet. Anschließend wurden die Würmer auf Platten mit FITC-Dextran (B-D) übertragen, mit Ausnahme der Fahrzeugsteuerung (A). (E) Die FITC-Fluoreszenzintensität zeigt an, dass die Darmdurchlässigkeit von C. elegans durch DIM beeinflusst wurde. Säulen und Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD an. ***P < 0,001 für signifikante Differenz zur Fahrzeugsteuerung. P< 0,001 und P < 0,01 für signifikanten Unterschied zu den FITC-dextran-behandelten Würmern, die mit P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5) gefüttert werden. Diese Grafik ist repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’-diindolylmethane  Sigma D9568
90×15 mm Petri dishes SPL Life Sciences, South Korea 10090
Bactor Agar Beckton Dickinson REF. 214010
Formaldehyde solution  Sigma F1635
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Wild type 
Cholesterol Sigma C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene Corning Incorporated REF. 3631
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran Sigma FD10S
Harmony software  PerkinElmer verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate  Fisher Bioreagents BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System PerkinElmer  HH16000000
Peptone Merck EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01 Korean Collection for Type Culture KCTC NO. 1637
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-1
Stereo Microscope Nikon, Japan SMZ800N

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