फिटसी-डेक्सट्रान फीडिंग: सी एलिगेंस में आंतों की पारतुजिबिलिटी को निर्धारित करने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो कीड़े फिटसी-लेबल डेक्सट्रान को खिलाकर सी एलिगेंस आंत ल्यूमेन की अखंडता की कल्पना और मापने की एक विधि का परिचय देता है।  उदाहरण प्रोटोकॉल 3,3'-डाइंडोडिलमेथेन (डीआईएम) के साथ किए गए परख को दिखाता है- उपचारित और रोगजनक-खिलाया कीड़े।

Protocol

यह प्रोटोकॉल ले एट अलका एक अंश है, जो कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस,जे विस एक्सपी की आंतों की पारृमिता पर बैक्टीरिया और रसायनों के प्रभाव को मापता है। (2019).

1. पी एरुगिनोसा के साथ सी एलिगेंस फेड की आंतों की पारगम्यता पर एक रासायनिक (डीआईएम) के प्रभाव के परीक्षण के लिए एनजीएम प्लेटों की तैयारी
   1. पेप्टोन के 0.5 ग्राम, एनएसीएल के 0.6 ग्राम, आसुत पानी के 195 एमएल, एक चुंबकीय उभारक, और 500 मिली एसएल ग्लास बोतल (एनजीएम एगर) में 6.8 ग्राम एगर जोड़ें।
   2. पेप्टोन के 0.5 ग्राम, एनएसीएल के 0.6 ग्राम, आसुत पानी के 195 एमएल, और एक और 500 मिलीएल ग्लास बोतल (एनजीएम शोरबा) के लिए आगर के बिना एक चुंबकीय उभारने वाला जोड़ें।
   3. ऑटोक्लेव दो बोतलों (कदम 1.1-1.2 से), एक खाली 100 मिलीएल कांच की बोतल, और एक खाली 500 मिलीएल कांच की बोतल 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर। फिर, 30 मिनट के लिए पानी के स्नान में 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के लिए बोतलों युक्त माध्यम की अनुमति दें। एगर मीडियम को पानी के स्नान में रखें और अगले चरण के लिए शोरबा युक्त बोतल (चरण 1.2 से) निकालें।
   4. एनजीएम शोरबा में योजक रसायन जोड़ें: 1 एम सीएसीएल₂के 0.4 एमएल, इथेनॉल (एमसीएल) में कोलेस्ट्रॉल के 0.4 एमएल, 1 एम एमजीएसओ 4 के_0.4 एमएल और 1 एम केपीओ₄ के 10 एमसीएल (इन सभी घटकों को इथेनॉल में कोलेस्ट्रॉल के अलावा बंधी होना चाहिए)। फिर, मिश्रण को 55 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय उभारने के साथ अच्छी तरह से हिलाएं।
   5. डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ ऑटोक्लेव खाली 500 एमएल ग्लास बोतल और डीआईएम के साथ ऑटोक्लेव खाली 100 एमएल ग्लास बोतल को लेबल करें।
   6. डीआईएम-लेबल 100 एमएल बोतल में एनजीएम शोरबा के 50 एमएल स्थानांतरित करें। बोतल में 20 mM DIM स्टॉक के 500 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण।
      नोट: डीआइएम को डीएमएसओ (20 एमएम डिम स्टॉक) में भंग कर दिया जाता है।
   7. जल स्नान से एनजीएम एगर माध्यम को जल्दी से हटा दें, डीआईएम-लेबल वाली बोतल में एनजीएम आगार माध्यम का 50 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
   8. प्रत्येक 90 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में डीआईएम युक्त एनजीएम माध्यम का 20 एमएल एलिकोट रखें। लगभग पांच मंद युक्त एनजीएम प्लेटें इस कदम से बनाई जा सकती हैं।
      नोट: प्रत्येक एनजीएम प्लेट में मंद की अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन होगी।
   9. डीएमएसओ युक्त एनजीएम प्लेट तैयार करने के लिए एनजीएम शोरबा के 150 एमएल को डीएमएसओ लेबल वाली 500 एमएल बोतल में ट्रांसफर करें। बोतल में डीएमएसओ का 1.5 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
   10. डीएमएसओ लेबल वाली बोतल में एनजीएम एगर मीडियम का 150 एमएल डालकर अच्छी तरह मिला लें।
   11. प्रत्येक 90 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में डीएमएसओ युक्त एनजीएम माध्यम का 20 एमएल एलिकोट रखें। लगभग पंद्रह DMSO युक्त NGM प्लेटें इस कदम से बनाया जा सकता है ।
       नोट: प्रत्येक एनजीएम प्लेट में डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 0.5% होगी।
   12. कम से कम 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों को जमना और उपयोग तक उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
       नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
   13. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से ई कोलाई OP50 या पी aeruginosa PAO1 संस्कृति को हटा दें और एनजीएम प्लेटों पर फैलने से पहले संस्कृति को ठीक से भंवर करें।
   14. प्रत्येक ताजा एनजीएम आगर प्लेट पर ई कोलाई OP50 या पी aeruginosa PAO1 जीवाणु संस्कृति के ८०० μL रखो और प्लेटों को एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर सूखने की अनुमति देते हैं ।
       नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है। तीसरे प्रयोग(चित्रा 1)के लिए, दो DMSO युक्त NGM प्लेटें लाइव ई. कोलाई OP50 के साथ लेपित, एक DMSO युक्त NGM प्लेट लाइव पी aeruginosa PAO1 के साथ लेपित, और एक मंद युक्त एनजीएम प्लेट लाइव पी aeruginosa PAO1 के साथ लेपित तैयार किए गए थे ।
2. बैक्टीरिया या डीआईएम और फिटसी-डेक्सट्रान फीडिंग का उपचार
   1. भोजन के रूप में लाइव ई कोलाई OP50 के साथ पूरक एनजीएम प्लेटों पर 64 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर उम्र सिंक्रोनाइज्ड अंडे को इनक्यूबेट करें।
   2. उम्र-सिंक्रोनाइज्ड एल 4 लार्वा को एस-बफर के साथ धोएं और उन्हें (लगभग 500 से अधिक कीड़े) को विभिन्न बैक्टीरिया और रसायनों वाले उपचार एनजीएम प्लेटों में स्थानांतरित करें। उन्हें 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस्तेमाल किए जाने वाले बैक्टीरिया और रसायनों के अनुसार उपचार का समय 24 से ७२ घंटे तक हो सकता है । डीआईएम के चिकित्सीय या निवारक प्रभाव का मूल्यांकन रोगजनकों के साथ कीड़े का पूर्व उपचार करके और फिर डीआईएम (चिकित्सीय प्रभाव) के साथ कीड़े का इलाज करके या डीआईएम के साथ कीड़े का पूर्व उपचार करके और फिर रोगजनकों (निवारक प्रभाव) के साथ इलाज करके भी मूल्यांकन किया जा सकता है।
   3. फिटसी-डेक्सट्रान-सप्लीमेंट प्लेट्स तैयार करने के लिए, 4 मिलीग्राम फिटसी-डेक्सट्रान के साथ हीट-इनएक्टिवेटेड ई कोलाई OP50 के 2 एमएल मिलाएं। फिर, फिटसी-डेक्सट्रान और ई कोलाई OP50 मिश्रण के 100 माइक्रोन को बीस ताजा एनजीएम एगर प्लेटों (60 मिमी x 15 मिमी) में विभाजित करें और प्लेटों को एक साफ बेंच पर 1 घंटे के लिए सूखने दें।
      नोट: प्रत्येक एनजीएम प्लेट में फिटसी-डेक्सट्रान की अंतिम एकाग्रता 20 μg/mL होगी ।
   4. वाहन नियंत्रण उपचार के लिए फिटसी-डेक्सट्रान के बिना पांच ई कोलाई OP50 युक्त एनजीएम प्लेटें तैयार करें। इस उद्देश्य के लिए, प्रत्येक ताजा एनजीएम एगर प्लेटों (60 मिमी x 15 मिमी) में 100 माइक्रोन हीट-निष्क्रिय ई. कोलाई OP50 को विभाजित करें और प्लेटों को एक साफ बेंच पर 1 घंटे के लिए सूखने दें।
      नोट: प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के लिए, पंद्रह फिटसी-डेक्सटरान-पूरक एनजीएम प्लेटें और फिटसी-डेक्सट्रान के बिना पांच एनजीएम प्लेटों की आवश्यकता होती है।
   5. उपचार के 48 एच (चरण 2.2 से) के बाद, एस-बफर के साथ कीड़े को धोएं, कीड़े को फिटसी-डेक्सट्रान पूरक प्लेटों और फिटसी-डेक्सट्रान के बिना एनजीएम प्लेटों में स्थानांतरित करें, और प्लेटों को रात भर (14-15 घंटे) इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रत्येक उपचार समूह के लिए, फिटसी-डेक्सट्रान स्टेनिंग (या वाहन नियंत्रण भोजन) की 5 प्रतिकृति की आवश्यकता होती है।
   6. एस-बफर के साथ कीड़े को धोएं और उन्हें 1 घंटे के लिए ताजा एनजीएम आगर प्लेट में क्रॉल करने की अनुमति दें।
      नोट: प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के लिए, कुल 20 ताजा एनजीएम प्लेटों की आवश्यकता होती है। इस चरण में, आप एनजीएम प्लेट का उपयोग बिना या ई. कोलाई OP50 के साथ कर सकते हैं।
   7. एक काले 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट के प्रत्येक कुएं में 4% फॉर्मलडिहाइड समाधान का 50μL जोड़ें। फ्लोरेसेंस मापन के लिए प्रत्येक एनजीएम प्लेट से लगभग 50 कीड़े को प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। 1 से 2 मिनट के बाद, प्रत्येक कुएं से सभी फॉर्मलडिहाइड को अच्छी तरह से हटा दें और कुओं को कोट करने के लिए बढ़ते माध्यम के 100 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: फॉर्मलडिहाइड समाधान (4%) काड़ों को स्थिर करने और ठीक करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रत्येक उपचार समूह के लिए, छवि विश्लेषण के लिए 5 कुओं (5 प्रतिकृति) का उपयोग किया जाता है।
3. इमेजिंग सी Operetta इमेजिंग प्रणाली और फिटसी-डेक्सट्रान फ्लोरेसेंस तेज को मापने के द्वारा आंतों पारम क्षमता के निर्धारण के साथ elegans
   नोट: फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी का उपयोग ओपेरेटा सिस्टम के बजाय छवि विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
   1. फ्लोरेसेंस छवियों को कैप्चर करें और ओपेरेटा हाई-कंटेंट इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें और सद्भाव सॉफ्टवेयर के साथ छवियों का विश्लेषण करें।
   2. सद्भाव सॉफ्टवेयर में, ढक्कन खोलने के लिए और मशीन में प्लेट डालने के लिए आइकन खुला ढक्कन दबाएं।
   3. मापदंडों को निर्धारित करें।
   4. सेट अपपर क्लिक करें, प्लेट प्रकार (96-वेल कॉर्निंग फ्लैट-बॉटम) का चयन करें और चैनल (उज्ज्वल-फ़ील्ड और ईजीएफपी चैनल) जोड़ें।
   5. लेआउट को समायोजित करें। लेआउट चयनपर जाएं, और फिर ट्रैक का चयन करें और मापदंडों को समायोजित करें (1 माइक्रोन पर पहली तस्वीर, विमानों की संख्या 10 है, दूरी 1 माइक्रोन है)।
   6. उपचार कुओं में से एक का चयन करें और एक कैप्चर फील्ड और प्रेस टेस्ट यह जांचने के लिए कि रन प्रयोग अनुभाग में चित्र संतोषजनक हैं या नहीं।
   7. यदि चित्र संतोषजनक हैं, तो सेट अप अनुभाग पर लौटें और स्क्रीन के अंत में रीसेट आइकन दबाएं। फिर, सभी लक्षित कुओं और कब्जा क्षेत्रों की एक उपयुक्त संख्या का चयन करें।
   8. फिर से प्रयोग चलाने के लिए जाओ और प्लेट नाम दर्ज करें, तो प्रसंस्करण शुरू करने के लिए शुरू प्रेस ।
   9. फ्लोरेसेंस की तीव्रता को मापने के लिए, छवि विश्लेषण अनुभाग में जाएं और छवि को इनपुट करें। ईजीएफपी चैनल और विधि बी का चयन करके सेल का पता लगाएं। आम सीमा को 0.5, क्षेत्र को और अधिक से अधिक 200 माइक्रोन^2,विभाजन कारक को 3.0, व्यक्तिगत सीमा 0.18 और 0.18 से अधिक के विपरीत समायोजित करें। फिर, तीव्रता गुणों की गणना करें और आउटपुट के रूप में मतलब चुनें। सेटअप को बचाने के लिए लागू आइकन दबाएं।
   10. हीटमैप और डेटा टेबल प्राप्त करके तीव्रता को मापने के लिए मूल्यांकन अनुभाग पर जाएं। कोशिकाओं के लिए Readout पैरामीटर सेट -तीव्रता सेल EGFP मतलब-अच्छी तरह से मतलब है और मूल्यांकन शुरू करते हैं ।
       नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
   11. ओपेरेटा से डेटा निकालने के लिए, सेटिंग बटन पर क्लिक करें और डेटा प्रबंधनचुनें।
   12. लिखें संग्रह चुनें,और फिर ब्राउज़ खोलें और फ़ाइल का चयन करें।
   13. फ़ाइल का चयन करने के लिए, बाएं कोने पर छोटे + सिग्नल पर क्लिक करें, और फिर माप पर क्लिक करें और प्लेट नामचुनें।
   14. फाइल का चयन करें और ओकेपर क्लिक करें।
   15. सक्रिय पथ पर ब्राउज़ सिग्नल पर क्लिक करके फ़ाइल को बचाने के लिए पथ का चयन करें।
   16. डेटा फ़ाइल को सहेजने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।
       नोट: यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।
4. सी एलिगेंस के फिटसी-डेक्सट्रान फ्लोरेसेंस का सांख्यिकीय विश्लेषण
   1. डेटा आयात करें और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके औसत और मानक विचलन (एसडी) की गणना करें।
   2. ट्यूकी के कई तुलना परीक्षण के बाद विचरण (ANOVA) के एक तरफा विश्लेषण के साथ महत्वपूर्ण अंतर का विश्लेषण करें।

Representative Results

चित्रा 1: सी एलिगेंस की आंतों की पारगम्यता पर डीआईएम का प्रभाव पी एरुगिनोसा खिलाया । फिटीसी-डेक्सट्रान फीडिंग के साथ(ए) ई कोलाई OP50 से कीड़े की माइक्रोस्कोपी छवियां,(बी) ई. कोलाई फिटसी-डेक्सट्रान फीडिंग के साथ,(सी) पी एरुगिनोसा PAO1 के साथ फिटसी-डेक्सट्रान फीडिंग, और(डी) पी एरुगिनोसा और डीआईएम (१०० M) कोलिटर के साथ फिटसी-डेक्सट्रान फीडिंग के साथ । स्केल बार = 1 मिमी (सफेद), और 200 माइक्रोन (काला)। उम्र-सिंक्रोनाइज्ड एल4 लार्वा को जी ई. कोलाई (ए, बी),लाइव पी एरुगिनोसा (सी),लाइव पी एरुगिनोसा और डीआईएम(डी)के साथ वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था। फिर, वाहन नियंत्रण(ए)को छोड़कर, कीड़े को फिटसी-डेक्सट्रान(बी-डी)वाली प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया। (ई)फिटसी फ्लोरेसेंस तीव्रता इंगित करती है कि सी एलिगेंस की आंत पारमशीलता मंद से प्रभावित थी । कॉलम और त्रुटि सलाखों के वाहन नियंत्रण से महत्वपूर्ण अंतर के लिए एसडी ± मतलब संकेत मिलता है । ***पी & ०.००१ । ^###पी एंड एलटी; ०.००१ और ^##पी < ०.०१ फिटसी-डेक्सट्रान-इलाज कीड़े से महत्वपूर्ण अंतर के लिए पी एरुगिनोसा PAO1 (ANOVA, n = 5) के साथ खिलाया । यह ग्राफ दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N