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Encyclopedia of Experiments

FITC-Dextran 먹이: C. 예인선에서 장 투과성을 정량화하는 방법

Overview

이 비디오는 FITC 라벨이 부착된 dextran을 공급하여 C. 엘레간장 루멘의 무결성을 시각화하고 측정하는 방법을 소개합니다.  이 예제 프로토콜은 3,3'-diindolylmethane (DIM)처리 및 병원균 공급 벌레로 수행 된 분석법을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 Le 외에서발췌한 것으로, 카노르하비티스 엘레건의 장 내 투과성에 대한 박테리아와 화학 물질의 효과를 측정, J. Vis. Exp. (2019).

  1. 화학 물질의 효과 테스트하기위한 NGM 플레이트의 준비 (DIM) P. aeruginosa와 공급 C. 느릅 잎의 장 투과성에
    1. 펩톤 0.5g, NaCl 0.6g, 증류수 195mL, 마그네틱 교반기, 6.8g의 한고를 500mL 유리병(NGM agar)에 넣습니다.
    2. 펩톤 0.5g, NaCl 0.6g, 증류수 195mL, 한천 없이 마그네틱 교반기를 500mL 유리병(NGM 국물)에 추가합니다.
    3. 두 병(1.1~1.2단계), 빈 100mL 유리병 1개, 빈 500mL 유리병 1개 1병 1개를 121°C에서 15분 동안 자동 클래브합니다. 그런 다음, 병을 함유한 배지가 30분 동안 수조에서 55°C까지 식힙니다. 수조에 한천 매체를 보관하고 다음 단계로 국물이 들어 있는 병을 제거합니다(1.2단계에서).
    4. NGM 국물에 첨가: 0.4 mL 의 1 M CaCl2,0.4 mL의 에탄올 (mL), 0.4 mL 의 1 M MgSO4 및 10 mL의 1 M KPO4 (이러한 성분의 모든 에탄올콜레스테롤과 분리되어야 함). 그런 다음 55°C에서 자기 교반기로 혼합물을 철저히 저어줍니다.
    5. 오토클레이브 빈 500mL 유리 병에 디메틸 설프리산화물(DMSO)과 자동 100mL 유리 병에 DIM이 부착된 라벨을 부착합니다.
    6. NGM 국물의 50mL를 DIM 라벨100mL 병으로 옮기습니다. 병에 20mM DIM 스톡의 500 μL을 넣고 잘 섞습니다.
      참고: DIM은 DMSO(20m DIM 주식)에 용해됩니다.
    7. 수조에서 NGM 한천 매체를 빠르게 제거하고 NGM 한천 배지50mL을 DIM 라벨병에 넣고 완전히 섞습니다.
    8. 각 90mm x 15mm 페트리 접시에 DIM 함유 NGM 배지의 20mL 알리쿼트를 놓습니다. 이 단계에서 약 5개의 DIM 함유 NGM 플레이트를 만들 수 있습니다.
      참고: 각 NGM 플레이트의 DIM의 최종 농도는 100 μM입니다.
    9. DMSO 함유 NGM 플레이트를 준비하려면 150mL의 NGM 국물을 DMSO 라벨500mL 병으로 옮기다. 병에 DMSO 1.5 mL을 넣고 잘 섞습니다.
    10. NgM 한천 배지 150mL를 DMSO 라벨병에 넣고 완전히 섞어줍니다.
    11. 각 90mm x 15mm 페트리 접시에 DMSO 함유 NGM 배지의 20mL 알리쿼트를 놓습니다. 약 15개의 DMSO 함유 NGM 플레이트는 이 단계에서 이루어질 수 있다.
      참고: 각 NGM 플레이트에서 DMSO의 최종 농도는 0.5%입니다.
    12. 적어도 3 시간 동안 실온에서 플레이트를 고공하고 사용할 때까지 4 °C에 저장합니다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
    13. 4°C 냉장고에서 대장균 OP50 또는 P. aeruginosa PAO1 배양을 제거하고 NGM 플레이트에 퍼지기 전에 배양을 제대로 소용돌이시다.
    14. 대장균 OP50 또는 P. aeruginosa PAO1 세균 배양의 800 μL을 각각의 신선한 NGM 한천 접시에 넣고 플레이트가 하룻밤 사이에 20°C 인큐베이터에서 건조되도록 합니다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 세 번째실험(도 1)의경우, 라이브 대장균 OP50으로 코팅된 DMSO 함유 NGM 플레이트 2개, 라이브 P. aeruginosa PAO1로 코팅된 DMSO 함유 NGM 플레이트 1개, 라이브 P. aeruginosa PAO1로 코팅된 DIM 함유 NGM 플레이트 1개가 준비되었다.
  2. 박테리아 또는 DIM 및 FITC-dextran 먹이의 치료
    1. 식품으로 살아있는 대장균 OP50으로 보충된 NGM 플레이트에서 64h에 대해 20°C에서 연령 동기화 된 계란을 배양합니다.
    2. 노화 동기화 된 L4 애벌레를 S 버퍼로 세척하고 다른 박테리아와 화학 물질을 포함하는 치료 NGM 플레이트로 전송 (약 500 개 이상의 벌레). 48h에 대해 20 °C에서 배양하십시오.
      참고: 처리 시간은 사용된 박테리아 및 화학제품에 따라 24에서 72 시간까지 구역 수색할 수 있습니다. DIM의 치료 또는 예방 효과는 또한 병원체로 벌레를 전처리한 다음 DIM (치료 효과)으로 벌레를 치료하거나 희미한 벌레를 전처리한 다음 병원체 (예방 효과)로 치료함으로써 평가될 수 있습니다.
    3. FITC-dextran 보충 플레이트를 준비하려면 2mL의 열 비활성화 E. 대장균 OP50을 FITC-dextran 4 mg과 혼합합니다. 그런 다음 FITC-dextran 및 E. coli OP50 혼합물의 100 μL을 20개의 신선한 NGM 한천 플레이트(60mm x 15mm)로 나누고 깨끗한 벤치에서 1시간 동안 플레이트를 건조시합니다.
      참고: 각 NGM 플레이트의 FITC-dextran의 최종 농도는 20 μg/mL입니다.
    4. 차량 제어 처리를 위해 FITC-dextran 없이 5개의 대장균 OP50 함유 NGM 플레이트를 준비합니다. 이를 위해 100μL 열 비활성화 E. 대장균 OP50을 각 신선한 NGM 한천 플레이트(60mm x 15mm)에 나누고 깨끗한 벤치에서 1시간 동안 플레이트를 건조시다.
      참고: 각 독립적인 실험에 대해 FITC-dextran 보충 NGM 플레이트 15개와 FITC-dextran이 없는 NGM 플레이트 5개가 필요합니다.
    5. 48h의 치료 후(2.2단계에서) 웜을 S 버퍼로 세척하고, FITC-dextran 보충 플레이트및 NGM 플레이트로 웜을 FITC-dextran 없이 옮기고, 하룻밤 사이에 플레이트를 배양한다(14-15h).
      참고: 각 치료 그룹에 대해 FITC-dextran 염색 (또는 차량 제어 공급)의 5 복제가 필요합니다.
    6. 웜을 S 버퍼로 세척하고 신선한 NGM 한천 접시에서 1시간 동안 크롤링할 수 있도록 합니다.
      참고: 각 독립적인 실험마다 총 20개의 신선한 NGM 플레이트가 필요합니다. 이 단계에서는 대장균 OP50 없이 또는 함께 보충된 NGM 플레이트를 사용할 수 있습니다.
    7. 블랙 96웰 플랫 하단 플레이트의 각 웰에 4% 포름알데히드 용액의 50 μL을 추가합니다. 각 NGM 플레이트에서 약 50개의 웜을 각 우물로 이송하여 형광 측정을 합니다. 1-2분 후, 각 우물에서 포름알데히드를 모두 철저히 제거하고 100 μL의 장착 매체를 추가하여 우물을 코팅합니다.
      참고: 포름알데히드 용액 (4%) 웜을 고정하고 수정하는 데 사용됩니다. 각 치료 그룹에 대해 5 개의 우물 (5 복제)이 이미지 분석에 사용됩니다.
  3. FITC-dextran 형광 섭취를 측정하여 오페레타 이미징 시스템과 장 투과성의 측정을 가진 이미징 C. 엘레간
    참고: 형광 스테레오 마이크로 스캔은 Operetta 시스템 대신 이미지 분석에 사용할 수 있습니다.
    1. 오페레타 고함량 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미지를 캡처하고 형광 강도를 측정하고 하모니 소프트웨어로 이미지를 분석합니다.
    2. 하모니 소프트웨어에서 아이콘 열기 뚜껑을 눌러 뚜껑을 열고 접시를 기계에 넣습니다.
    3. 매개 변수를 설정합니다.
    4. 설정을클릭하고 플레이트 유형(96웰 코닝 플랫 하부)을 선택하고 채널(밝은 필드 및 EGFP 채널)을 추가합니다.
    5. 레이아웃을 조정합니다. 레이아웃 선택으로이동한 다음 트랙을 선택하고 매개 변수를 조정합니다(첫 번째 그림 1 μm, 평면 수는 10, 거리는 1 μm).
    6. 치료 우물 중 하나와 하나의 캡처 필드와 프레스 테스트를 선택하여 실행 실험 섹션에서 사진이 만족스러운지 확인합니다.
    7. 사진이 만족스럽지 않으면 설정 섹션으로 돌아가 화면 끝에 있는 리셋 아이콘을 누릅니다. 그런 다음 모든 대상 우물과 적절한 수의 캡처 필드를 선택합니다.
    8. 실험을 다시 실행한 다음 플레이트 이름을 입력한 다음 시작하여 처리를 시작합니다.
    9. 형광의 강도를 측정하려면 이미지 분석 섹션으로 이동하여 이미지를 입력합니다. EGFP 채널 및 방법 B.를 선택하여 셀을 찾아0.5로 공통 임계값을 조정하고, 영역은 >200 μm2로,분할계를 3.0으로, 개별 임계값은 0.18이상으로 대조된다. 그런 다음 강도 속성을 계산하고 평균을 출력으로 선택합니다. 적용 아이콘을 눌러 설정을 저장합니다.
    10. 평가 섹션으로 이동하여 히트맵 및 데이터 테이블을 획득하여 강도를 측정합니다. 셀에 읽기 매개 변수를 설정 — 강도 셀 EGFP 평균 — 음당 평균 및 평가를 시작합니다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
    11. Operetta에서 데이터를 추출하려면 설정 버튼을 클릭하고 데이터 관리를 선택합니다.
    12. 아카이브 쓰기를선택한 다음 찾아보기를 열고 파일을 선택합니다.
    13. 파일을 선택하려면 왼쪽 모서리에 있는 작은 + 신호를 클릭한 다음 측정을 클릭하고 플레이트 이름을 선택합니다.
    14. 파일을 선택하고 확인을 클릭합니다.
    15. 활성 경로에서 찾아보기 신호를 클릭하여 파일을 저장할 경로를 선택합니다.
    16. 데이터 파일을 저장하려면 시작을 클릭합니다.
      참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
  4. C. 예르간의 FITC-dextran 형광의 통계 분석
    1. 데이터를 가져오고 통계 소프트웨어를 사용하여 평균 및 표준 편차(SD)를 계산합니다.
    2. 차이(ANOVA)의 단방향 분석과 Tukey의 다중 비교 테스트와 함께 중요한 차이를 분석합니다.

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Representative Results

Figure 1
그림 1: C. 아레간의 장 투과성에 딤의 효과는 P. aeruginosa를공급했다.  (A)FITC-dextran 급유를 하지 않고 대장균 OP50,(B)FITC-dextran 급식을 통한 대장균, (C) P. aeruginosa PAO1 FITC-dextran 급유,(D) P. aeruginosa 및 DIM (100 μM) 스케일 바 = 1mm(흰색) 및 200 μm(검정). 연령 동기화 L4 애벌레는 살아있는 대장균(A, B),라이브 P. aeruginosa (C),라이브 P. aeruginosa 및 DIM(D)로시드 NGM 플레이트에서 48 h에 대한 배양되었다. 이어서, 웜은 FITC-dextran(B-D)을포함하는플레이트로 옮겨졌으며, 차량제어(A)를제외하고는. (E)FITC 형광 강도는 C. 예르건의 직자 투과성이 DIM의 영향을 받았다는 것을 나타냅니다 ±. ###P< 0.001 및 ##P< 0.01 P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5)로 공급FITC-dextran 처리 웜과 상당한 차이. 이 그래프는 두 개의 독립적인 실험을 대표합니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’-diindolylmethane  Sigma D9568
90×15 mm Petri dishes SPL Life Sciences, South Korea 10090
Bactor Agar Beckton Dickinson REF. 214010
Formaldehyde solution  Sigma F1635
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Wild type 
Cholesterol Sigma C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene Corning Incorporated REF. 3631
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran Sigma FD10S
Harmony software  PerkinElmer verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate  Fisher Bioreagents BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium Sigma F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System PerkinElmer  HH16000000
Peptone Merck EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01 Korean Collection for Type Culture KCTC NO. 1637
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-1
Stereo Microscope Nikon, Japan SMZ800N

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