Overview
이 비디오는 FITC 라벨이 부착된 dextran을 공급하여 C. 엘레간장 루멘의 무결성을 시각화하고 측정하는 방법을 소개합니다. 이 예제 프로토콜은 3,3'-diindolylmethane (DIM)처리 및 병원균 공급 벌레로 수행 된 분석법을 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 Le 외에서발췌한 것으로, 카노르하비티스 엘레건의 장 내 투과성에 대한 박테리아와 화학 물질의 효과를 측정, J. Vis. Exp. (2019).
- 화학 물질의 효과 테스트하기위한 NGM 플레이트의 준비 (DIM) P. aeruginosa와 공급 C. 느릅 잎의 장 투과성에
- 펩톤 0.5g, NaCl 0.6g, 증류수 195mL, 마그네틱 교반기, 6.8g의 한고를 500mL 유리병(NGM agar)에 넣습니다.
- 펩톤 0.5g, NaCl 0.6g, 증류수 195mL, 한천 없이 마그네틱 교반기를 500mL 유리병(NGM 국물)에 추가합니다.
- 두 병(1.1~1.2단계), 빈 100mL 유리병 1개, 빈 500mL 유리병 1개 1병 1개를 121°C에서 15분 동안 자동 클래브합니다. 그런 다음, 병을 함유한 배지가 30분 동안 수조에서 55°C까지 식힙니다. 수조에 한천 매체를 보관하고 다음 단계로 국물이 들어 있는 병을 제거합니다(1.2단계에서).
- NGM 국물에 첨가: 0.4 mL 의 1 M CaCl2,0.4 mL의 에탄올 (mL), 0.4 mL 의 1 M MgSO4 및 10 mL의 1 M KPO4 (이러한 성분의 모든 에탄올콜레스테롤과 분리되어야 함). 그런 다음 55°C에서 자기 교반기로 혼합물을 철저히 저어줍니다.
- 오토클레이브 빈 500mL 유리 병에 디메틸 설프리산화물(DMSO)과 자동 100mL 유리 병에 DIM이 부착된 라벨을 부착합니다.
- NGM 국물의 50mL를 DIM 라벨100mL 병으로 옮기습니다. 병에 20mM DIM 스톡의 500 μL을 넣고 잘 섞습니다.
참고: DIM은 DMSO(20m DIM 주식)에 용해됩니다. - 수조에서 NGM 한천 매체를 빠르게 제거하고 NGM 한천 배지50mL을 DIM 라벨병에 넣고 완전히 섞습니다.
- 각 90mm x 15mm 페트리 접시에 DIM 함유 NGM 배지의 20mL 알리쿼트를 놓습니다. 이 단계에서 약 5개의 DIM 함유 NGM 플레이트를 만들 수 있습니다.
참고: 각 NGM 플레이트의 DIM의 최종 농도는 100 μM입니다. - DMSO 함유 NGM 플레이트를 준비하려면 150mL의 NGM 국물을 DMSO 라벨500mL 병으로 옮기다. 병에 DMSO 1.5 mL을 넣고 잘 섞습니다.
- NgM 한천 배지 150mL를 DMSO 라벨병에 넣고 완전히 섞어줍니다.
- 각 90mm x 15mm 페트리 접시에 DMSO 함유 NGM 배지의 20mL 알리쿼트를 놓습니다. 약 15개의 DMSO 함유 NGM 플레이트는 이 단계에서 이루어질 수 있다.
참고: 각 NGM 플레이트에서 DMSO의 최종 농도는 0.5%입니다. - 적어도 3 시간 동안 실온에서 플레이트를 고공하고 사용할 때까지 4 °C에 저장합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 4°C 냉장고에서 대장균 OP50 또는 P. aeruginosa PAO1 배양을 제거하고 NGM 플레이트에 퍼지기 전에 배양을 제대로 소용돌이시다.
- 대장균 OP50 또는 P. aeruginosa PAO1 세균 배양의 800 μL을 각각의 신선한 NGM 한천 접시에 넣고 플레이트가 하룻밤 사이에 20°C 인큐베이터에서 건조되도록 합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 세 번째실험(도 1)의경우, 라이브 대장균 OP50으로 코팅된 DMSO 함유 NGM 플레이트 2개, 라이브 P. aeruginosa PAO1로 코팅된 DMSO 함유 NGM 플레이트 1개, 라이브 P. aeruginosa PAO1로 코팅된 DIM 함유 NGM 플레이트 1개가 준비되었다.
- 박테리아 또는 DIM 및 FITC-dextran 먹이의 치료
- 식품으로 살아있는 대장균 OP50으로 보충된 NGM 플레이트에서 64h에 대해 20°C에서 연령 동기화 된 계란을 배양합니다.
- 노화 동기화 된 L4 애벌레를 S 버퍼로 세척하고 다른 박테리아와 화학 물질을 포함하는 치료 NGM 플레이트로 전송 (약 500 개 이상의 벌레). 48h에 대해 20 °C에서 배양하십시오.
참고: 처리 시간은 사용된 박테리아 및 화학제품에 따라 24에서 72 시간까지 구역 수색할 수 있습니다. DIM의 치료 또는 예방 효과는 또한 병원체로 벌레를 전처리한 다음 DIM (치료 효과)으로 벌레를 치료하거나 희미한 벌레를 전처리한 다음 병원체 (예방 효과)로 치료함으로써 평가될 수 있습니다. - FITC-dextran 보충 플레이트를 준비하려면 2mL의 열 비활성화 E. 대장균 OP50을 FITC-dextran 4 mg과 혼합합니다. 그런 다음 FITC-dextran 및 E. coli OP50 혼합물의 100 μL을 20개의 신선한 NGM 한천 플레이트(60mm x 15mm)로 나누고 깨끗한 벤치에서 1시간 동안 플레이트를 건조시합니다.
참고: 각 NGM 플레이트의 FITC-dextran의 최종 농도는 20 μg/mL입니다. - 차량 제어 처리를 위해 FITC-dextran 없이 5개의 대장균 OP50 함유 NGM 플레이트를 준비합니다. 이를 위해 100μL 열 비활성화 E. 대장균 OP50을 각 신선한 NGM 한천 플레이트(60mm x 15mm)에 나누고 깨끗한 벤치에서 1시간 동안 플레이트를 건조시다.
참고: 각 독립적인 실험에 대해 FITC-dextran 보충 NGM 플레이트 15개와 FITC-dextran이 없는 NGM 플레이트 5개가 필요합니다. - 48h의 치료 후(2.2단계에서) 웜을 S 버퍼로 세척하고, FITC-dextran 보충 플레이트및 NGM 플레이트로 웜을 FITC-dextran 없이 옮기고, 하룻밤 사이에 플레이트를 배양한다(14-15h).
참고: 각 치료 그룹에 대해 FITC-dextran 염색 (또는 차량 제어 공급)의 5 복제가 필요합니다. - 웜을 S 버퍼로 세척하고 신선한 NGM 한천 접시에서 1시간 동안 크롤링할 수 있도록 합니다.
참고: 각 독립적인 실험마다 총 20개의 신선한 NGM 플레이트가 필요합니다. 이 단계에서는 대장균 OP50 없이 또는 함께 보충된 NGM 플레이트를 사용할 수 있습니다. - 블랙 96웰 플랫 하단 플레이트의 각 웰에 4% 포름알데히드 용액의 50 μL을 추가합니다. 각 NGM 플레이트에서 약 50개의 웜을 각 우물로 이송하여 형광 측정을 합니다. 1-2분 후, 각 우물에서 포름알데히드를 모두 철저히 제거하고 100 μL의 장착 매체를 추가하여 우물을 코팅합니다.
참고: 포름알데히드 용액 (4%) 웜을 고정하고 수정하는 데 사용됩니다. 각 치료 그룹에 대해 5 개의 우물 (5 복제)이 이미지 분석에 사용됩니다.
- FITC-dextran 형광 섭취를 측정하여 오페레타 이미징 시스템과 장 투과성의 측정을 가진 이미징 C. 엘레간
참고: 형광 스테레오 마이크로 스캔은 Operetta 시스템 대신 이미지 분석에 사용할 수 있습니다.- 오페레타 고함량 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미지를 캡처하고 형광 강도를 측정하고 하모니 소프트웨어로 이미지를 분석합니다.
- 하모니 소프트웨어에서 아이콘 열기 뚜껑을 눌러 뚜껑을 열고 접시를 기계에 넣습니다.
- 매개 변수를 설정합니다.
- 설정을클릭하고 플레이트 유형(96웰 코닝 플랫 하부)을 선택하고 채널(밝은 필드 및 EGFP 채널)을 추가합니다.
- 레이아웃을 조정합니다. 레이아웃 선택으로이동한 다음 트랙을 선택하고 매개 변수를 조정합니다(첫 번째 그림 1 μm, 평면 수는 10, 거리는 1 μm).
- 치료 우물 중 하나와 하나의 캡처 필드와 프레스 테스트를 선택하여 실행 실험 섹션에서 사진이 만족스러운지 확인합니다.
- 사진이 만족스럽지 않으면 설정 섹션으로 돌아가 화면 끝에 있는 리셋 아이콘을 누릅니다. 그런 다음 모든 대상 우물과 적절한 수의 캡처 필드를 선택합니다.
- 실험을 다시 실행한 다음 플레이트 이름을 입력한 다음 시작하여 처리를 시작합니다.
- 형광의 강도를 측정하려면 이미지 분석 섹션으로 이동하여 이미지를 입력합니다. EGFP 채널 및 방법 B.를 선택하여 셀을 찾아0.5로 공통 임계값을 조정하고, 영역은 >200 μm2로,분할계를 3.0으로, 개별 임계값은 0.18이상으로 대조된다. 그런 다음 강도 속성을 계산하고 평균을 출력으로 선택합니다. 적용 아이콘을 눌러 설정을 저장합니다.
- 평가 섹션으로 이동하여 히트맵 및 데이터 테이블을 획득하여 강도를 측정합니다. 셀에 읽기 매개 변수를 설정 — 강도 셀 EGFP 평균 — 음당 평균 및 평가를 시작합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - Operetta에서 데이터를 추출하려면 설정 버튼을 클릭하고 데이터 관리를 선택합니다.
- 아카이브 쓰기를선택한 다음 찾아보기를 열고 파일을 선택합니다.
- 파일을 선택하려면 왼쪽 모서리에 있는 작은 + 신호를 클릭한 다음 측정을 클릭하고 플레이트 이름을 선택합니다.
- 파일을 선택하고 확인을 클릭합니다.
- 활성 경로에서 찾아보기 신호를 클릭하여 파일을 저장할 경로를 선택합니다.
- 데이터 파일을 저장하려면 시작을 클릭합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
- C. 예르간의 FITC-dextran 형광의 통계 분석
- 데이터를 가져오고 통계 소프트웨어를 사용하여 평균 및 표준 편차(SD)를 계산합니다.
- 차이(ANOVA)의 단방향 분석과 Tukey의 다중 비교 테스트와 함께 중요한 차이를 분석합니다.
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Representative Results
그림 1: C. 아레간의 장 투과성에 딤의 효과는 P. aeruginosa를공급했다. (A)FITC-dextran 급유를 하지 않고 대장균 OP50,(B)FITC-dextran 급식을 통한 대장균, (C) P. aeruginosa PAO1 FITC-dextran 급유,(D) P. aeruginosa 및 DIM (100 μM) 스케일 바 = 1mm(흰색) 및 200 μm(검정). 연령 동기화 L4 애벌레는 살아있는 대장균(A, B),라이브 P. aeruginosa (C),라이브 P. aeruginosa 및 DIM(D)로시드 NGM 플레이트에서 48 h에 대한 배양되었다. 이어서, 웜은 FITC-dextran(B-D)을포함하는플레이트로 옮겨졌으며, 차량제어(A)를제외하고는. (E)FITC 형광 강도는 C. 예르건의 직자 투과성이 DIM의 영향을 받았다는 것을 나타냅니다 ±. ###P< 0.001 및 ##P< 0.01 P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5)로 공급FITC-dextran 처리 웜과 상당한 차이. 이 그래프는 두 개의 독립적인 실험을 대표합니다.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
Cholesterol | Sigma | C3045 | |
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N |