FITC-Dextran Feeding: En metode for å kvantifisere intestinal permeabilitet i C. elegans

Overview

Denne videoen introduserer en metode for å visualisere og måle integriteten til C. elegans tarm lumen ved å mate ormer FITC-merket dextran.  Eksempelprotokollen viser analysen som er gjort med 3,3'-diindolylmethane (DIM)-behandlede og patogenfôrede ormer.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Le et al, Måle effekten av bakterier og kjemikalier på intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans,J. Vis. Exp. (2019).

1. Forberedelse av NGM-plater for testing av effekten av et kjemikalie (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans matet med P. aeruginosa
   1. Tilsett 0,5 g peptone, 0,6 g NaCl, 195 ml destillert vann, en magnetisk omrører og 6,8 g agar til en 500 ml glassflaske (NGM-agar).
   2. Tilsett 0,5 g peptone, 0,6 g NaCl, 195 ml destillert vann og en magnetisk omrører uten agar til en annen 500 ml glassflaske (NGM-buljong).
   3. Autoklaver de to flaskene (fra trinn 1.1-1.2), en tom 100 ml glassflaske og en tom 500 ml glassflaske i 15 minutter ved 121 °C. La deretter mediet som inneholder flasker avkjøles til 55 °C i vannbadet i 30 minutter. Oppbevar agarmediet i vannbadet og fjern flasken som inneholder kjøttkraft (fra trinn 1.2) for neste trinn.
   4. Tilsett additivkjemikalier til NGM-buljongen: 0,4 ml 1 M CaCl_2,0,4 ml kolesterol i etanol (ml), 0,4 ml 1 M MgSO₄ og 10 ml 1 M KPO₄ (alle disse komponentene må steriliseres bortsett fra kolesterolet i etanol). Rør deretter blandingen grundig med en magnetisk omrører ved 55 °C.
   5. Merk den autoklavede tomme 500 ml glassflasken med dimetylsulfoksid (DMSO) og den autoklavede tomme 100 ml glassflasken med DIM.
   6. Overfør 50 ml NGM-kjøttkraft til dim-merket 100 ml flaske. Tilsett 500 μL 20 mM DIM-lager i flasken og bland godt.
      MERK: DIM oppløses i DMSO (20 mM DIM lager).
   7. Fjern raskt NGM-agarmediet fra vannbadet, tilsett 50 ml NGM-agarmedium i dim-merket flaske og bland grundig.
   8. Legg et 20 ml aliquot AV DIM-inneholdende NGM-medium i hver 90 mm x 15 mm Petri-tallerken. Omtrent fem DIM-inneholdende NGM-plater kan gjøres fra dette trinnet.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av DIM i hver NGM-plate vil være 100 μM.
   9. For å klargjøre den DMSO-inneholdende NGM-platen, overfør 150 ml NGM-buljong til den DMSO-merkede 500 ml flasken. Tilsett 1,5 ml DMSO i flasken og bland godt.
   10. Tilsett 150 ml NGM-agarmedium i den DMSO-merkede flasken og bland grundig.
   11. Legg et 20 ml aliquot DMSO-inneholdende NGM-medium i hver 90 mm x 15 mm Petri-tallerken. Omtrent femten DMSO-inneholdende NGM-plater kan gjøres fra dette trinnet.
       MERK: Den endelige konsentrasjonen av DMSO i hver NGM-plate vil være 0,5%.
   12. Størk platene ved romtemperatur i minst 3 timer og oppbevar dem ved 4 °C til bruk.
       MERK: Protokollen kan settes på pause her.
   13. Fjern E. coli OP50- eller P. aeruginosa PAO1-kulturen fra 4 °C kjøleskapet og virvel kulturen ordentlig før du sprer deg på NGM-platene.
   14. Sett 800 μL av E. coli OP50 eller P. aeruginosa PAO1 bakteriekultur på hver ferske NGM-agarplate og la platene tørke i en 20 ° C inkubator over natten.
       MERK: Protokollen kan settes på pause her. For det tredje eksperimentet (figur 1),ble to DMSO-inneholdende NGM-plater belagt med levende E. coli OP50, en DMSO-inneholdende NGM-plate belagt med levende P. aeruginosa PAO1, og en DIM-inneholdende NGM-plate belagt med levende P. aeruginosa PAO1 utarbeidet.
2. Behandling av bakterier eller DIM og FITC-dextran fôring
   1. Inkuber de alderssynkroniserte eggene ved 20 °C i 64 timer på NGM-plater supplert med levende E. coli OP50 som mat.
   2. Vask den alderssynkroniserte L4 larven med S-buffer og overfør dem (mer enn ca. 500 ormer) til behandlingen NGM-plater som inneholder forskjellige bakterier og kjemikalier. Inkuber dem ved 20 °C i 48 timer.
      MERK: Behandlingstiden kan variere fra 24 til 72 timer, i henhold til bakteriene og kjemikaliene som brukes. Den terapeutiske eller forebyggende effekten av DIM kan også evalueres ved å forbehandle ormene med patogener og deretter behandle ormene med DIM (den terapeutiske effekten) eller ved å forbehandle ormene med DIM og deretter behandle med patogener (den forebyggende effekten).
   3. For å klargjøre FITC-dextran-supplerte plater, bland 2 ml varmeinaktivert E. coli OP50 med 4 mg FITC-dextran. Del deretter 100 μL av FITC-dextran- og E. coli OP50-blandingen i tjue friske NGM-agarplater (60 mm x 15 mm) og la platene tørke i 1 time på en ren benk.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av FITC-dextran i hver NGM-plate vil være 20 μg/ml.
   4. Klargjør fem E. coli OP50-inneholdende NGM-plater uten FITC-dextran for kjøretøykontrollbehandling. Til dette formål, del 100 μL varmeinaktivert E. coli OP50 til hver ferske NGM-agarplater (60 mm x 15 mm) og la platene tørke i 1 time på en ren benk.
      MERK: For hvert uavhengig eksperiment kreves femten FITC-dextran-supplerte NGM-plater og fem NGM-plater uten FITC-dextran.
   5. Etter 48 timers behandling (fra trinn 2.2), vask ormene med S-buffer, overfør ormene til FITC-dextran supplerte plater og NGM-platene uten FITC-dextran, og inkuber platene over natten (14-15 h).
      MERK: For hver behandlingsgruppe er det nødvendig med 5 replikeringer av FITC-dextran farging (eller kjøretøykontrollfôring).
   6. Vask ormene med S-buffer og la dem krype i den ferske NGM-agarplaten i 1 time.
      MERK: For hvert uavhengig eksperiment er det nødvendig med totalt 20 ferske NGM-plater. I dette trinnet kan du bruke NGM-platen supplert uten eller med E. coli OP50.
   7. Tilsett 50 μL 4% formaldehydløsning til hver brønn av en svart 96-brønns flatbunnsplate. Overfør ca. 50 ormer fra hver NGM-plate til hver brønn for fluorescensmålinger. Etter 1 til 2 min, fjern grundig all formaldehyd fra hver brønn og tilsett 100 μL monteringsmedium for å belegge brønnene.
      MERK: Formaldehydoppløsning (4 %) brukes til å immobilisere og fikse ormene. For hver behandlingsgruppe brukes 5 brønner (5 replikeringer) til bildeanalyse.
3. Imaging C. elegans med Operetta Imaging System og Bestemmelse av intestinal permeabilitet ved å måle FITC-dextran fluorescens opptak
   MERK: Fluorescerende stereomikroskopi kan brukes til bildeanalyse i stedet for Operetta-systemet.
   1. Ta fluorescensbilder og mål fluorescensintensiteten ved hjelp av Operetta High-Content Imaging System og analyser bildene med Harmony-programvare.
   2. I Harmony-programvaren trykker du på ikonet Åpne lokket for å åpne lokket og sette platen inn i maskinen.
   3. Definer parameterne.
   4. Klikk Oppsett, velg platetypen (96-brønns corning flat-bottom) og legg til kanalene (bright-field og EGFP kanaler).
   5. Juster oppsettet. Gå til Oppsettvalg, og velg deretter Spor og juster parameterne (første bilde ved 1 μm, antall plan er 10, avstanden er 1 μm).
   6. Velg en av behandlingsbrønnene og ett fangstfelt, og trykk test for å kontrollere om bildene er tilfredsstillende i Kjør eksperiment-delen.
   7. Hvis bildene er tilfredsstillende, går du tilbake til Oppsett-delen og trykker tilbakestill-ikonet på slutten av skjermen. Velg deretter alle målbrønnene og et passende antall fangstfelt.
   8. Gå til Kjør eksperiment på nytt og skriv inn platenavnet, og trykk deretter start for å begynne behandlingen.
   9. For å måle intensiteten til fluorescensen, gå til bildeanalysedelen og skriv inn bildet. Finn cellen ved å velge EGFP-kanal og metode B. Juster den felles terskelen til 0,5, areal til >200 μm², delt faktor til 3,0, individuell terskel til 0,18 og kontrast til mer enn 0,18. Deretter beregner du intensitetsegenskapene og velger gjennomsnittet som utdata. Trykk på Bruk-ikonet for å lagre oppsettet.
   10. Gå til Evaluering-delen for å måle intensiteten ved å hente et varmekart og en datatabell. Sett Viktig-parameteren til Celler – Gjennomsnitt for intensitetscelle EGFP – Gjennomsnitt per brønn og start evalueringen.
       MERK: Protokollen kan settes på pause her.
   11. Hvis du vil trekke ut dataene fra Operetta, klikker du Innstilling -knappen og velger Databehandling.
   12. Velg Skriv arkiv, og åpne deretter bla gjennom og velg filen.
   13. Hvis du vil merke filen, klikker du det lille + signalet i venstre hjørne, og deretter klikker du Mål og velger Platenavn.
   14. Merk filen, og klikk OK.
   15. Velg banen for å lagre filen ved å klikke Bla gjennom-signalet i den aktive banen.
   16. Klikk Start for å lagre datafilen.
       MERK: Protokollen kan settes på pause her.
4. Statistisk analyse av FITC-dextran fluorescens av C. elegans
   1. Importer dataene og beregn middelverdi og standardavvik (SD) ved hjelp av en statistikkprogramvare.
   2. Analyser den signifikante forskjellen med enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukeys multisammenligningstest.

Representative Results

Figur 1: Effekten av DIM på intestinal permeabilitet av C. elegans matet P. aeruginosa. Mikroskopi bilder av ormer fra (A) E. coli OP50 uten FITC-dextran fôring, (B) E. coli med FITC-dextran fôring, (C) P. aeruginosa PAO1 med FITC-dextran fôring, og (D) P. aeruginosa og DIM (100 μM) cotreatment med FITC-dextran fôring. Skalastang = 1 mm (hvit) og 200 μm (svart). Alderssynkroniserte L4 larver ble inkubert i 48 timer i NGM-plater frøet med levende E. coli (A, B), levende P. aeruginosa (C), levende P. aeruginosa og DIM (D). Deretter ble ormene overført til plater som inneholder FITC-dextran (B-D), bortsett fra kjøretøykontrollen (A). (E) FITC fluorescensintensitet indikerer at tarmens permeabilitet av C. elegans ble påvirket av DIM. Kolonner og feilfelt indikerer gjennomsnittlig ± SD. ***P < 0,001 for betydelig forskjell fra kjøretøykontrollen. ^###P < 0,001 og ^##P < 0,01 for signifikant forskjell fra FITC-dextranbehandlede ormer matet med P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5). Denne grafen er representativ for to uavhengige eksperimenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N