FitC-Dextran Кормление: Метод количественной оценки проницаемости кишечника в C. elegans

Overview

Это видео вводит метод визуализации и измерения целостности C. elegans кишечника люмена путем кормления червей FITC помечены декстран.  Пример протокола показывает анализ, проделанной с 3,3'-diindolylmethane (DIM)-обработанных и патогенных червей.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Le et al, Измерение воздействия бактерий и химических веществ на кишечной проницаемости Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Подготовка NGM пластин для тестирования воздействия химического вещества (DIM) на проницаемость кишечника C. elegans Fed с P. aeruginosa
   1. Добавьте 0,5 г пептона, 0,6 г NaCl, 195 мл дистиллированной воды, магнитный мешалка и 6,8 г агара в стеклянную бутылку 500 мл (NGM agar).
   2. Добавьте 0,5 г пептона, 0,6 г NaCl, 195 мл дистиллированной воды и магнитный мешалка без агара еще 500 мл стеклянной бутылки (ngM бульон).
   3. Автоклав две бутылки (от ступеней 1,1-1,2), одна пустая стеклянная бутылка 100 мл и одна пустая стеклянная бутылка 500 мл в течение 15 мин при 121 градусе по Цельсию. Затем дайте среде, содержащей бутылки, остыть до 55 градусов по Цельсию в водяной бане в течение 30 минут. Держите агар среды в водяной бане и удалить бутылку, содержащую бульон (от шага 1.2) для следующего шага.
   4. Добавьте в бульон NGM добавочные химические вещества: 0,4 мл 1 M CaCl₂, 0,4 мл холестерина в этаноле (мл), 0,4 мл 1 M MgSO₄ и 10 мл 1 M KPO₄ (все эти компоненты должны быть стерилизованы отдельно от холестерина в этаноле). Затем тщательно перемешайте смесь с помощью магнитного мешалки при 55 градусов по Цельсию.
   5. Этикетка autoclaved пустой 500 мл стеклянная бутылка с диметил сульфоксид (DMSO) и autoclaved пустой 100 мл стеклянная бутылка с DIM.
   6. Перенесите 50 мл бульона NGM в бутылку с маркировкой DIM 100 мл. Добавьте в бутылку 500 МКЛ из 20 мМ DIM бульона и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DIM растворяется в DMSO (20 мМ ДИМ запасов).
   7. Быстро удалите NGM агар среды из водяной бани, добавить 50 мл NGM агар среды в DIM помечены бутылку и тщательно перемешать.
   8. Поместите 20 мл aliquot DIM-содержащих NGM среды в каждом 90 мм х 15 мм Петри блюдо. Приблизительно пять DIM-содержащих ngM пластин могут быть сделаны из этого шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация DIM в каждой пластине NGM будет 100 МКМ.
   9. Для приготовления пластины, содержащей DMSO NGM, перенесите 150 мл бульона NGM в бутылку с маркировкой DMSO 500 мл. Добавить 1,5 мл DMSO в бутылку и хорошо перемешать.
   10. Добавьте 150 мл агарной среды NGM в бутылку с маркировкой DMSO и тщательно перемешайте.
   11. Поместите 20 мл aliquot DMSO-содержащих NGM среды в каждом 90 мм х 15 мм Петри блюдо. Примерно пятнадцать DMSO-содержащих NGM пластин может быть сделано из этого шага.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация DMSO в каждой пластине NGM будет 0,5%.
   12. Затвердеть пластины при комнатной температуре, по крайней мере 3 ч и хранить их при температуре 4 градусов по Цельсию до использования.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
   13. Удалите культуру E. coli OP50 или P. aeruginosa PAO1 из холодильника с 4 градусами Цельсия и должным образом вихрем культуры перед распространением на пластины NGM.
   14. Положите 800 йл E. coli OP50 или P. aeruginosa PAO1 бактериальной культуры на каждой свежей пластины Агара NGM и позволить пластины высохнуть в инкубаторе 20 градусов по Цельсию на ночь.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Для третьего эксперимента(рисунок 1),были подготовлены две пластины, содержащие DMSO NGM, покрытые живой кишечной палочкой OP50, одна пластина DMSO, содержащая NGM, покрытая живой P. aeruginosa PAO1, и одна пластина, содержащая DIM NGM, покрытая живой P. aeruginosa PAO1.
2. Лечение бактерий или DIM и FITC-декстран кормления
   1. Инкубировать возраст синхронизированные яйца при 20 градусов по Цельсию для 64 ч на NGM пластин, дополненных живой кишечной палочки OP50 в качестве пищи.
   2. Вымойте возраст синхронизированную личинку L4 с помощью S-буфера и перенесите их (более 500 червей) на лечебные пластины NGM, содержащие различные бактерии и химические вещества. Инкубировать их при 20 градусов по Цельсию в течение 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время лечения может варьироваться от 24 до 72 ч, в соответствии с бактериями и химическими веществами, используемыми. Терапевтический или профилактический эффект DIM также может быть оценен путем предварительной обработки червей с патогенными микроорганизмами, а затем лечения червей с DIM (терапевтический эффект) или предварительной обработки червей с DIM, а затем лечение с патогенами (профилактическое действие).
   3. Для приготовления fitC-dextran-дополненных пластин, смешать 2 мл тепловой инактивированной кишечной палочки OP50 с 4 мг FITC-декстрана. Затем разделите 100 МКЛ смеси FITC-dextran и E. coli OP50 на двадцать свежих агарных пластин NGM (60 мм х 15 мм) и дайте пластинам высохнуть в течение 1 ч на чистой скамейке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация FITC-декстрана в каждой пластине NGM будет 20 мкг/мл.
   4. Подготовь пять пластин E. coli OP50, содержащих NGM, без FITC-декстрана для обработки управления транспортным средством. Для этого разделите 100 МКЛ теплоактивированных E. coli OP50 на каждую свежую агарную пластину NGM (60 мм х 15 мм) и дайте пластинам высохнуть в течение 1 ч на чистой скамейке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого независимого эксперимента требуется пятнадцать пластин NGM с fitC-dextran и пять пластин NGM без FITC-декстрана.
   5. После 48 ч лечения (от шага 2.2), мыть червей с S-буфер, передать червей FITC-декстран дополненные пластины и NGM пластин без FITC-декстран, и инкубировать пластины на ночь (14-15 ч).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой группы лечения требуется 5 репликаций окрашивания FITC-dextran (или кормления управления транспортным средством).
   6. Вымойте червей С-буфером и позвольте им ползать в свежей агарной пластине NGM в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого независимого эксперимента требуется в общей сложности 20 свежих пластин NGM. На этом этапе можно использовать ngM пластины дополняется без или с кишечной палочкой OP50.
   7. Добавьте 50 мкл 4% раствора формальдегида к каждой колодец черной пластины с плоским дном 96-колодец. Перенесите около 50 червей с каждой пластины NGM в каждую колодец для измерения флуоресценции. После 1 до 2 мин, тщательно удалить все формальдегид из каждой скважины и добавить 100 йл монтажа среды для покрытия скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегидное решение (4%) используется для обездвиживания и фиксации червей. Для каждой группы обработки для анализа изображений используются 5 скважин (5 репликаций).
3. Изображение C. elegans с системой визуализации оперетты и определением кишечной проницаемости путем измерения FITC-декстранного поглощения флуоресценции
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная стереомикроскопия может быть использована для анализа изображений вместо системы оперетты.
   1. Захват флуоресценции изображений и измерения интенсивности флуоресценции с помощью Operetta High-Content Imaging System и анализировать изображения с помощью программного обеспечения Гармония.
   2. В программном обеспечении Harmony нажмите на значок Open lid, чтобы открыть крышку и положить пластину в машину.
   3. Настройка параметров.
   4. Нажмите Настройка, выберите тип пластины (96-хорошо corning плоский дно) и добавить каналы (яркое поле и EGFP каналов).
   5. Отрегулируйте макет. Перейти к выбору Layout, а затем выбрать трек и настроить параметры (первая картина на 1 мкм, количество самолетов 10, расстояние 1 мкм).
   6. Выберите одну из лечебных скважин и одну область захвата и нажмите Test, чтобы проверить, являются ли фотографии удовлетворительными в разделе эксперимента Run.
   7. Если изображения являются удовлетворительными, вернитесь в раздел Настройка и нажмите значок сброса в конце экрана. Затем выберите все целевые скважины и подходящее количество полей захвата.
   8. Перейти к запуску эксперимент снова и ввести имя пластины, а затем нажмите Начало, чтобы начать обработку.
   9. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции, перейдите в раздел анализа изображений и ввемите изображение. Найдите ячейку, выбрав канал EGFP и метод B. Отрегулируйте общий порог до 0,5, область до 200^{мкм 2}, коэффициент разделения до 3,0, индивидуальный порог до 0,18 и контраст более чем на 0,18. Затем вычислите свойства интенсивности и выберите среднее время в качестве вывода. Нажмите значок Apply, чтобы сохранить настройку.
   10. Перейдите в раздел Оценка для измерения интенсивности, получив тепловую карту и таблицу данных. Установите параметр считывания для ячеек - Интенсивность ячейки EGFP Средний - Среднее за Ну и начать оценку.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
   11. Чтобы извлечь данные из Operetta, нажмите кнопку Настройки и выберите управление данными.
   12. Выберите архивWrite, а затем откройте просмотр и выберите файл.
   13. Чтобы выбрать файл, щелкните небольшой сигнал в левом углу, а затем нажмите Измерение и выберите имя плиты.
   14. Выберите файл и нажмите OK.
   15. Выберите путь для сохранения файла, нажав на сигнал Просмотра на активном пути.
   16. Нажмите Начните, чтобы сохранить файл данных.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.
4. Статистический анализ FITC-декстрана флуоресценции C. elegans
   1. Импорт данных и вычислить среднее и стандартное отклонение (SD) с помощью программного обеспечения статистики.
   2. Проанализируйте существенную разницу с помощью однократного анализа дисперсии (ANOVA), за которым следует многократный сравнительный тест Туки.

Representative Results

Рисунок 1: Влияние ДИМ на проницаемость кишечника C. elegans кормили P. aeruginosa. Микроскопические изображения червей из (A) E. coli OP50 без кормления FITC-декстран, ( B )E. coli с FITC-декстран кормления, ( C )P. aeruginosa PAO1 с FITC-декстран кормления, и ( D )P. aeruginosa и DIM (100 МК) cotreatment с FITC-дектранса кормления. Шкала планки 1 мм (белый) и 200 мкм (черный). Возраст синхронизированные личинки L4 были инкубированы на 48 ч в NGM пластин, посеянных с живой кишечной палочки (A, B), жить P. aeruginosa (C), жить P. aeruginosa и DIM (D). Затем черви были переведены на пластины, содержащие FITC-декстран (B-D), за исключением управления транспортным средством (A). (E)Интенсивность флуоресценции FITC указывает на то, что проницаемость кишечника C. elegans была затронута DIM. Колонны и бары ошибок указывают среднее значение ± SD. ^P Lt; 0.001 и PLt; 0.01 для существенного отличия от FITC-декстран-обработанных червей, питаемых P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n No 5). Этот график является репрезентативным для двух независимых экспериментов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’-diindolylmethane	Sigma	D9568
90×15 mm Petri dishes	SPL Life Sciences, South Korea	10090
Bactor Agar	Beckton Dickinson	REF. 214010
Formaldehyde solution	Sigma	F1635
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		Wild type
Cholesterol	Sigma	C3045
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene	Corning Incorporated	REF. 3631
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Fluorescein isothiocyanate - dextran	Sigma	FD10S
Harmony software	PerkinElmer		verson 3.5
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Bioreagents	BP2213-1
Fluoromount aqueous mounting medium	Sigma	F4680
Operetta CLS High-Content Analysis System	PerkinElmer	HH16000000
Peptone	Merck	EMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01	Korean Collection for Type Culture	KCTC NO. 1637
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-1
Stereo Microscope	Nikon, Japan	SMZ800N