Микроинъекция Гонада: Метод доставки соединения непосредственно в зародыш C. elegans

Overview

Это видео описывает микроинъекции, распространенный метод создания трансгенных штаммов C. elegans.   В этом примере мы увидим микроинъекцию, используемую для внедрения комплекса рибонуклеопротеина (RNP) для редактирования генов CRISPR-баз.

Protocol

Следующий протокол является выдержка из Farboud и др., Улучшенная редактирование генома с Cas9 Ribonucleoprotein в различных клеток и организмов, J. Vis. Exp. (2018).

1. Ассамблея РНП

1. Разработать эксперимент заблаговременно, приобретая все РНК, ДНК и белковые компоненты заранее. В качестве первого прохода попробуйте один из положительных элементов управления, перечисленных в таблице 1, и используйте коммерческие реагенты, описанные в таблице материалов, для обеспечения надежного экспериментального проектирования и целостности материалов. Дополнительные советы по планированию нового эксперимента по редактированию генома можно посмотреть в работах на эту тему.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После сборки, как описано в последующих шагах, РНП, подготовленные заранее, могут храниться при -80 градусов по Цельсию.
   1. После выбора гена для таргетинга используйте один из бесплатных онлайн-инструментов для разработки оптимальной гРНК. Будьте уверены, чтобы цель exon, если надеясь создать нокаут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти инструменты помогут определить целевой сайт с соседней последовательностью PAM S. pyogenes, высококачественным баллом и низким баллом вне цели.
   2. Очистить белок S. pyogenes Cas9 с помощью опубликованных методов или приобрести его у коммерческого поставщика.
   3. Подготовь типичный буфер Cas9 для разбавления РНК, препарата RNP и хранения белка, который содержит 20 мМ HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 10% глицерола и 1 мМ TCEP. Всегда используйте воду без нуклеазы в буферах, которые будут использоваться для повторного использования или разбавления РНК для предотвращения деградации.
   4. Производить руководство РНК (tracrRNA и crRNA или sgRNA) с помощью транскрипции in vitro с использованием опубликованных методов, или приобрести его у компании по синтезу нуклеиновой кислоты.
   5. При вставке гена синтезировать или приобрести шаблон донорской ДНК.
   6. Храните белок и РНК-алициты при -80 градусов по Цельсию и оттаивать на льду непосредственно перед употреблением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая заморозка-оттепель немного снижает эффективность. Подробные протоколы открытого доступа для очистки Cas9 и транскрипции sgRNAs в пробирке доступны в других местах.
2. RNP подготовка к C. редактирование elegans: Соберите комплекс RNP, добавив следующие реагенты для создания окончательного объема в 20 мкл (окончательные концентрации отмечены в скобках): Cas9 (2 МКМ), HEPES pH 7.5 (10 МКМ ККл (115 МКМ), крРНК (12 МКМ), тракр РНК (40 МКМ) и шаблоны ремонта, если это необходимо (0,5 МКМ ssDNA или до 350 нг/ДЛ dsDNA).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность ремонта при посредничестве Cas9 при посредничестве DSB пропорционально концентрации конструкции ремонта dsDNA; таким образом, чем выше концентрация шаблона ремонта, тем эффективнее шаблонный ремонт. Тем не менее, было показано, что инъекция смесей, содержащих более 350 нг/йл цДДНА, снижает жизнеспособность инъекционных червей. Таким образом, лучше всего использовать до, но не более 350 нг/ йл dsDNA в смеси, чтобы максимизировать эффективность ремонта при минимизации его летальности.
   1. Добавьте несколько CRRNAs для таргетинга нескольких локусов одновременно, по мере необходимости для подхода к скринингу совместного CRISPR/co-conversion. При добавлении более одного crRNA, добавить каждый последовательно мастер смеси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество каждой крРНК не должно быть одинаковым, и даже удвоение общей концентрации мРНК в мастер-миксе без изменения концентрации Cas9, по-видимому, не мешает частоте мутагенеза в определенном локусе. Примеры подробно описаны в Paix et al.
   2. Смешайте с помощью пипетки и спина RNP решение на 16000 х г на 5 с, чтобы убедиться, что решение собирается в нижней части трубки.
   3. Инкубировать раствор при 37 градусов по Цельсию на 15 м.
   4. Центрифуга образца на 16000 х г в течение 1 мин гранулы любые частицы, которые могли бы засорить тонкой скучной микроинъекции иглы. Используйте супернатант в последующих шагах.
3. C. Элеганс Подготовка

1. 1 день до микроинъекции: Подготовка агарозы колодки для микроинъекции.

1. Сделайте 3% (w/v) раствор агарозы в воде, добавив агарозу в воду и доведя раствор до кипения на горячей тарелке или в микроволновой печи.
2. Упорядочить 24 мм х 50 мм х 1,5 мм крышка стеклянные слайды на столе и использовать стеклянную пипетку Пастер разместить небольшой (15 йл) капли агарозы раствор на слайде. Быстро сгладить агароза падение, поместив другой крышкой на вершине. Разрешить агарозы затвердеть, а затем удалить один из coverslips.
3. Оставьте агарозы покрытием крышки лицом вверх на столешницу на ночь, чтобы высохнуть. После 24 ч, хранить агарозные прокладки в чистом, сухом контейнере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Они могут быть использованы на неопределенный срок.

2. Потяните микроинъекции иглы: с помощью борозиликатных стеклянных капилляров с нитей (внешний диаметр 1,0 мм и внутренний диаметр 0,58 мм), тянуть иглы на основе Мелло и Fire^{57 и} другие ресурсы. Иглы могут быть использованы немедленно или могут храниться в чистом, сухом контейнере, скобки глиняных опор.

3. Для поддержания червей, подготовить Nematode Рост СМИ (NGM) агар вылил в Петри пластин и пятнистый с бактериями OP50 (для протоколов по стандартному C. elegans обслуживания и рецепты для роста средств массовой информации, см. Stiernagle).

4. Этап червей для микроинъекции: 12-24 ч до микроинъекции, выбрать L4-постановка гермафродитов на новую пластину NG-агара с бактериями OP50 и инкубировать их на ночь при 20 градусов по Цельсию. Для каждой целевой/инъекционной смеси Cas9 выберите на тарелку 30 червей.

4. День микроинъекции: Загрузите вытянутую микроинъекцию иглы с супернатантом раствора RNP, подготовленным в шаге 1.2.
   1. Пипетт супернатант из шага 1.2.4 в вытянутую капиллярную пипетку и засовывь раствор из капиллярной пипетки в подготовленную микроинъекцию иглы (обычно загружается менее 0,1 МЛ).
5. Накренив загруженную иглу на микроинъекции аппарата, прикрепленного к микроманипулятору. Установите давление инъекционного аппарата до 250 кПа и давление баланса до 25 кПа.
6. Разбей заряженный кончик иглы, чтобы создать острый край иглы. Поместите 15 мм х 15 мм х 1,5 мм квадратный крышку на верхней части 24 мм х 50 мм х 1,5 мм крышки.
   1. Наложить один край квадрата крышки с галоуглеродным маслом 700.
   2. Распоить иглу в масле, на краю 15 мм квадратных крышки.
   3. Используя руку для руководства стадии микроскопа и крышки, кисть слайд вверх и вдоль края иглы в то время как удручает педаль инъекции / кнопку. Разбей кончик иглы назад, увеличив поток жидкости из иглы. Достичь оптимальной скорости потока, сделав инъекцию смесь течь вверх по краю иглы, образуя No 1 пузырь / с.
7. Подтвердите, что черви L4 выбрали 12-24 ч до микроинъекции являются развития поставил молодых людей в день инъекции. Выберите молодых взрослых червей на NG-агар пластины, которая не имеет OP50 бактерий и позволить им ползать в течение 5 минут. Это уменьшает количество бактерий, переданных на инъекцию площадку, сводя к минимуму иглы забивает.
8. Поместите агарозную инъекционной площадку/крышку на область вскрытия. Используя червя выбрать, заложить небольшой трек галоуглеродного масла вдоль одного края площадки.
9. Используя червя забрать покрытием в масле, снять несколько червей от NG-агар пластины и в след нефти. С тонкой волосы прилагается к пипетке, таких как ресницы или кошки усы, положение червей параллельно, мягко толкая червей в агарозы площадку. До тех пор, пока комфортно с процедурой микроинъекции, только монтировать и вводить один червь за один раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сухая агароза будет фитиль влаги от червей, заставляя их придерживаться площадку. Следовательно, нужно работать быстро, как черви могут высохать.
   1. Оказавшись в положении и прикрепленный к колодке, наложить червей с еще несколько капель галоуглеродного масла (20 йл) от кончика червя забрать.
10. C. elegans Гонад Микроинъекции с РНК и после инъекций Уход
    Протокол микроинъекции адаптирован из Мелло и Огня и подробно описан в другом месте.
    1. Поместите крышку с установленными червями на инъекционный микроскоп. При низком увеличении (5X цель, 10X глазной), положение червей перпендикулярно инъекционной иглы.
       1. Переключитесь на высокое увеличение (40X цель, 10X глазной), перепозиционировать иглу, прилегающую к гонадной руке, соответствующей области вблизи ядер в середине-конце пахитена.
       2. Используя микроманипулятор, перемести иглу против червя, слегка угнетая кутикулу. Затем, одной рукой, нажмите на сторону стадии микроскопа, чтобы протряхить иглу через кутикулу. Депрессия педаль инъекции / кнопка и медленно заполнить гонад руку с инъекцией смеси и удалить иглу.
       3. Повторите этот шаг с другой гонадной рукой.
    2. После того, как черви вводят, удалить coverslip / агароза площадку и поместить его под рассечение микроскопа.
       1. Используя вытащил капиллярной пипетки, вытеснить масло из червей, трубя буфер M9 над ними. Выполните это лечение, чтобы освободить червей от агара.
       2. Через 10 минут, когда черви обмолота вокруг в буфере, переместить их в NG-агар пластины с бактериями OP50 с помощью вытащил капиллярной пипетки. Поместите пластину на 20 градусов по Цельсию в течение 2-3 ч, пока черви не выздоровеют и не будут двигаться.
    3. После выздоровления, индивидуально перенесите червей на NG-агарные пластины с OP50 и перенесите пластины в инкубатор 25 градусов по Цельсию.
    4. Разрешить P₀-инъекционных червей расти и заложить потомство в течение 3 дней. Экран F₁ потомство.
       1. При использовании совместного CRISPR или совместного преобразования, а затем выбрать кандидата червей для скрининга на основе того, есть ли у них мутант фенотип эталонного гена. Индивидуально перенесите эти отмеченные черви на новые NG-агарные пластины с OP50 и позвольте им заложить потомство F₂ при 20 градусах Цельсия.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотип, используемый для совместного скрининга или отбора CRISPR, должен обеспечить раннюю оценку успеха редактирования Cas9.
       2. Если фенотипа CO-CRISPR нет, микроинъекции положительной плазмиды контроля, чтобы помочь в повышении эффективности микроинъекции.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Например, включение плазмиды в смесь инъекций, которая кодирует MYO-2 с тегами mCherry, поможет оценить эффективность инъекций. Черви успешно вводят с pCFJ90 будет иметь некоторое потомство с флуоресцентными глотками.
    5. Изучите_червей F 1 на наличие желаемых правок. Выберите F_{1 мать} индивидуального хорошо 96-хорошо пластины, лизировать ее, и изучить ее ДНК либо вставить конкретных ПЦР усиления, анализ последовательности ДНК, или геодезист нуклеазы анализа (CEL-1).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эти анализы могут быть выполнены при использовании совместного CRISPR / совместного преобразования или других режимов скрининга или отбора.

Representative Results

Таблица 1: Положительные элементы управления для предварительных экспериментов по редактированию генома. В этой таблице показана ключевая информация, необходимая для проведения первого эксперимента по редактированию генома в каждой из клеток и организмов, описанных в этом протоколе. Следовая этим параметрам, скорее всего, даст успешный результат, который может быть использован для тестирования протокола или в качестве базовой линии для сравнения, как только экспериментатор ориентируется на ген, представляющий их собственный интерес. F: вперед, R: обратный, HDR: гомологии направленного ремонта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой таблицы.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar