Gonad Microinjection: שיטה של משלוח מורכב ישירות לתוך הנבט של C. אלגנס

Overview

וידאו זה מתאר microinjection, שיטה נפוצה של יצירת זנים מהונדסים C. elegans.   בדוגמה, נראה microinjection המשמש להצגת קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי CRISPR.

Protocol

הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Farboud et al, עריכת גנום משופרת עם Cas9 ריבונוקלאופרוטאין בתאים ואורגניזמים מגוונים, J. Vis. Exp. (2018).

1. הרכבת RNP

1. תכנן את הניסוי מבעוד מועד, ורכש מראש את כל רכיבי ה- RNA, ה- DNA והחלבון. כמעבר ראשון, נסה את אחד הפקדים החיוביים המפורטים בטבלה 1 והשתמש בריגנטים המסחריים המתוארים בטבלת החומרים כדי להבטיח עיצוב ניסיוני אמין ושלמות החומרים. לקבלת טיפים נוספים על תכנון ניסוי חדש לעריכת גנום, ראה מאמרים בנושא זה.
   שים לב: לאחר הרכבה כמתואר בשלבים הבאים, RNPs שהוכנו מראש עשויים להיות מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.
   1. לאחר בחירת איזה גן למקד, להשתמש באחד הכלים המקוונים חינם לעצב gRNA אופטימלי. הקפד למקד אקסון אם מקווה ליצור נוקאאוט.
      שים לב: כלים אלה יסייעו לזהות אתר יעד עם רצף PAM S. pyogenes סמוך, ציון באיכות גבוהה, וציון נמוך מחוץ ליעד.
   2. לטהר את החלבון S. pyogenes Cas9 באמצעות שיטות שפורסמו או לרכוש אותו מספק מסחרי.
   3. הכן מאגר Cas9 טיפוסי לדילול RNA, הכנת RNP ואחסון חלבונים, המכיל 20 מ"מ של HEPES pH 7.5, 150 מ"מ של KCl, 10% גליצרול ו- 1 מ"מ של TCEP. השתמש תמיד במים נטולי גרעין במאגרים שישמשו לשימוש חוזר או לדלל RNA כדי למנוע השפלה.
   4. לייצר את המדריך RNA (tracrRNA ו crRNA או sgRNA) באמצעות שעתוק במבחנה באמצעות שיטות שפורסמו, או לרכוש אותו מחברת סינתזת חומצת גרעין.
   5. אם אתם מכניסים גן, סנתזו או רכשו תבנית דנ"א של תורם.
   6. יש לאחסן את החלבון ואת ה-RNA ב-80°C ולהפשיר על הקרח מיד לפני השימוש.
      שים לב: כל הפשרה בהקפאה מפחיתה מעט את היעילות. פרוטוקולי גישה פתוחה מפורטים עבור טיהור Cas9 ותעתיק במבחנה של sgRNAs זמינים במקום אחר.
2. הכנת RNP ל-C. עריכת אלגנים: להרכיב את קומפלקס RNP על ידי הוספת ריאגנטים הבאים על מנת ליצור נפח סופי של 20 μL (הריכוזים הסופיים מצוינים בסוגריים): Cas9 (2 מיקרומטר), HEPES pH 7.5 (10 מיקרומטר ), KCl (115 מיקרומטר), crRNA (12 מיקרומטר), tracrRNA (40 מיקרומטר), ואת תבניות התיקון במידת הצורך (0.5 מיקרומטר ssDNA או עד 350 ng / μL dsDNA).
   שים לב: היעילות של תיקון בתבנית DSB בתיווך Cas9 היא פרופורציונלית לריכוז מבנה התיקון של dsDNA; לכן, ככל שהריכוז של תבנית התיקון גבוה יותר, כך התיקון בתבנית יעיל יותר. עם זאת, הזרקה של תערובות המכילות יותר מ 350 ng/μL של dsDNA הוכח להפחית את הכדאיות של התולעים מוזרק. לכן, עדיף להשתמש עד, אבל לא יותר מ 350 ng/μL של dsDNA בתמהיל כדי למקסם את יעילות התיקון תוך מזעור הקטלניות שלה.
   1. הוסף crRNAs מרובים כדי להתמקד לוקוסים מרובים בו זמנית, לפי הצורך עבור גישת סינון CO-CRISPR/שיתוף המרה. בעת הוספת יותר מ- crRNA אחד, הוסף כל אחד מהם ברצף לתערובת הראשית.
      שים לב: כמות כל crRNA לא צריך להיות זהה, ואפילו הכפלת הריכוז הכולל של crRNAs בתמהיל הראשי מבלי לשנות את הריכוז של Cas9 לא נראה להפריע לתדירות של mutagenesis בבית לוקוס מסוים. דוגמאות מתוארות בפירוט ב Paix ואח '.
   2. מערבבים על ידי pipetting ולסובב את פתרון RNP ב 16,000 x g עבור 5 s כדי להבטיח כי הפתרון נאסף בתחתית הצינור.
   3. דגירה הפתרון ב 37 °C (60 °F) עבור 15 מ '.
   4. צנטריפוגה המדגם ב 16,000 x g במשך 1 דקות כדי גלולה כל חלקיקים שיכולים לסתום את מחט microinjection דק משועמם. השתמש ב-supernatant בשלבים הבאים.
3. ג. הכנת אלגנס

1. יום אחד לפני microinjection: להכין את רפידות agarose עבור microinjection.

1. הפוך 3% (w / v) פתרון agarose במים על ידי הוספת agarose למים ולהביא את הפתרון לרתיחה על צלחת חמה או במיקרוגל.
2. סדר 24 מ"מ x 50 מ"מ x 1.5 מ"מ כיסוי שקופיות זכוכית על שולחן ולהשתמש פיפטה פסטר זכוכית למקם קטן (~ 15 μL) טיפה של פתרון agarose על השקופית. לשטח במהירות את טיפת agarose על ידי הנחת כיסוי אחר על גבי. אפשר את agarose כדי לחזק ולאחר מכן להסיר אחד coverslips.
3. השאירו את הכיסויים מצופים agarose עם הפנים כלפי מעלה על שולחן לילה לייבוש. לאחר 24 שעות, לאחסן את רפידות agarose במיכל נקי, יבש.
   שים לב: אלה יכולים לשמש ללא הגבלת זמן.

2. משוך את מחטי microinjection: באמצעות נימי זכוכית borosilicate עם חוטים (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ וקוטר פנימי 0.58 מ"מ), למשוך את המחטים מבוסס על מלו ואש⁵⁷ ומשאבים אחרים. ניתן להשתמש במחטים באופן מיידי או לאחסן במיכל נקי ויבש, מוצף תמיכות חימר.

3. לתחזוקת התולעים, הכינו אגר של Nematode Growth Media (NGM) שנשפך לתוך צלחות פטרי וזיהה עם חיידקי OP50 (לפרוטוקולים על תחזוקת C. elegans סטנדרטית ומתכונים למדיית צמיחה, ראה Stiernagle).

4. שלב את התולעים עבור microinjection: 12-24 שעות לפני microinjection, לבחור הרמפרודיטים מבוים L4 לצלחת חדשה NG-אגר עם חיידקי OP50 ולהדגיר אותם לילה ב 20 °C (60 °F). עבור כל תערובת יעד/הזרקה של Cas9, בחר ~ 30 תולעים לצלחת.

4. יום של microinjection: לטעון את המחט microinjection משך עם פתרון RNP supernatant מוכן בשלב 1.2.
   1. פיפטה supernatant משלב 1.2.4 לתוך פיפטה נימי משך למלא את הפתרון מן פיפטה נימי לתוך מחט microinjection מוכן (בדרך כלל טעינת פחות מ 0.1 μL).
5. הר את המחט טעונה על מנגנון microinjection מחובר micromanipulator. הגדר את לחץ מנגנון ההזרקה ל 250 kPa ואת לחץ האיזון ל 25 kPa.
6. לשבור בחזרה את קצה המחט טעון כדי ליצור קצה מחט חדה. הנח כיסוי מרובע של 15 מ"מ x 15 מ"מ x 1.5 מ"מ בחלק העליון של כיסוי של 24 מ"מ x 50 מ"מ x 1.5 מ"מ.
   1. כיסוי קצה אחד של כיסוי מרובע עם שמן halocarbon 700.
   2. מקם את המחט בשמן, בקצה החלקה המרובעת של 15 מ"מ.
   3. באמצעות יד כדי להנחות את שלב המיקרוסקופ ואת coverslip, לצחצח את השקופית לאורך קצה המחט תוך מדכא את דוושת ההזרקה / כפתור. לשבור את קצה המחט בחזרה, להגדיל את זרימת הנוזל מתוך המחט. להשיג קצב זרימה אופטימלי על ידי הפיכת תערובת ההזרקה לזרום לאורך קצה המחט, ויוצרים ~ 1 בועה / s.
7. ודא כי תולעי L4 הרים 12-24 שעות לפני microinjection הם מבוגרים צעירים מבוימים התפתחותית ביום ההזרקה. בחר את התולעים הבוגרות הצעירות לצלחת NG-אגר חסרה חיידקים OP50 ולאפשר להם לזחול סביב במשך 5 דקות. זה מקטין את כמות החיידקים המועברים כרית ההזרקה, מזעור כפכפים מחט.
8. מניחים כרית הזרקה agarose / כריכה על טווח ניתוח. בעזרת בחירת תולעים, הניחו מסלול קטן של שמן הולוגרבון לאורך קצה אחד של הפנקס.
9. באמצעות התולעת לבחור מצופה בשמן, להרים כמה תולעים את צלחת NG-אגר לתוך המסלול של שמן. עם שיער דק המחובר לפיפט, כגון ריס או שפם חתול, מקם את התולעים במקביל, דוחף בעדינות את התולעים לתוך כרית agarose. עד נוח עם הליך microinjection, רק לעלות ולהזריק תולעת אחת בכל פעם.
   שים לב: ההתעוררות היבשה תפתיל את הלחות מהתולעים, ותגרום להם לדבוק בפנקס. כתוצאה מכך, יש לעבוד במהירות כמו התולעים יכול להתייבש.
   1. פעם אחת בעמדה מחובר כרית, לכסות את התולעים עם עוד כמה טיפות של שמן halocarbon (~ 20 μL) מקצה התולעת לבחור.
10. C. אלגנס גונד מיקרו-לינקציה עם RNPs וטיפול לאחר הזרקה
    פרוטוקול המיקרו-injection מותאם ממלו ואש ומתואר בפירוט במקומות אחרים.
    1. מניחים את הכיסוי עם התולעים המותקנות על מיקרוסקופ ההזרקה. תחת הגדלה נמוכה (המטרה 5X, 10X עינית), מקם את התולעים בניצב למחט ההזרקה.
       1. עבור להגדלה גבוהה (40X אובייקטיבי, 10X עינית), למקם מחדש את המחט הסמוכה לזרוע gonad המתאים לאזור ליד הגרעינים באמצע עד מאוחר pachytene.
       2. באמצעות micromanipulator, להזיז את המחט נגד התולעת, מדכא את הקוטיקל מעט. לאחר מכן, ביד אחת, הקש על הצד של שלב המיקרוסקופ כדי לטלטל את המחט דרך הקוטיקל. לדכא את דוושת ההזרקה / כפתור ולאט לאט למלא את זרוע gonad עם תערובת ההזרקה ולהסיר את המחט.
       3. חזור על שלב זה עם זרוע האשור השנייה.
    2. לאחר הזרקת התולעים, הסירו את כרית הכיסוי/אגרוז והניחו אותה תחת מיקרוסקופ מנתח.
       1. באמצעות פיפטה נימי משך, לעקור את השמן מן התולעים על ידי pipetting חיץ M9 מעליהם. בצע טיפול זה כדי לשחרר את התולעים מן האגר.
       2. לאחר 10 דקות, כאשר התולעים מתרוצצים במאגר, להעביר אותם לצלחת NG-אגר עם חיידקי OP50 באמצעות פיפטה נימי משך. מניחים את הצלחת ב 20 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות עד התולעים התאוששו והם נעים מסביב.
    3. לאחר התאושש, בנפרד להעביר את התולעים ללוחות NG-אגר עם OP50 ולהעביר את הצלחות לחממה 25 מעלות צלזיוס.
    4. אפשר לתולעים P₀-מוזרק לגדול ולהניח צאצאים במשך 3 ימים. סנן אתצאצאי_האף-1.
       1. אם אתם משתמשים ב-CRISPR משותף או בהמרה משותפת, בחרו את התולעים המועמדות להקרנה בהתבסס על השאלה אם יש להן את הפנוטיפ המוטנטי של גן הייחוס. בנפרד להעביר תולעים מסומנות אלה ללוחות NG-אגר חדשים עם OP50 ולאפשר להם להניח F₂ צאצאים ב 20 °C (69 °F).
          שים לב: הפנוטיפ המשמש להקרנה או לבחירה של CRISPR משותף אמור לספק הערכה מוקדמת להצלחת העריכה של Cas9.
       2. אם הפנוטיפ המשותף של CRISPR אינו קיים, מיקרו-אינג'ק פלסמיד בקרה חיובית כדי לסייע בשיפור יעילות המיקרו-אינג'ינג.
          שים לב: לדוגמה, כולל פלסמיד בתמהיל ההזרקה המקודד את MYO-2 מתויג mCherry יעזור להעריך את יעילות ההזרקה. תולעים מוזרקים בהצלחה עם pCFJ90 יהיה כמה צאצאים עם הלוע פלואורסצנטי.
    5. בדוק את תולעי F₁ לקבלת נוכחות של העריכות הרצויות. בחר את האם F₁ לבאר בודדת של צלחת 96 באר, lyse אותה, ולבחון את ה-DNA שלה על ידי או הכנס ספציפי PCR הגברה, ניתוח רצף DNA, או בדיקת גרעין מודד (CEL-1).
       שים לב: ניתן לבצע מבחנים אלה בעת שימוש בהמרה משותפת של CRISPR/שיתוף פעולה או במשטרי סינון או בחירה אחרים.

Representative Results

טבלה 1: בקרות חיוביות לניסויים ראשוניים בעריכת גנום. טבלה זו מציגה את המידע העיקרי הדרוש לביצוע ניסוי עריכת גנום בפעם הראשונה בכל אחד מהתאים והאורגניזמים המתוארים בפרוטוקול זה. ביצוע פרמטרים אלה עשוי להניב תוצאה מוצלחת שניתן להשתמש בה כדי לבדוק את הפרוטוקול או כבסיס להשוואה ברגע שהנסיין מכוון לגן בעל אינטרס משלהם. ו: קדימה, R: הפוך, HDR: תיקון מונחה הומולוגיה. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של טבלה זו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar