غوند Microinjection: طريقة تسليم المركب مباشرة إلى الجرثومة من C. elegans

Overview

يصف هذا الفيديو الميكروبيكشن، وهي طريقة شائعة لخلق سلالات سي إليغانز المعدلة وراثيا.  في المثال، سنرى microinjection تستخدم لإدخال ريبونوكليوبروتين (RNP) مجمع لتحرير الجينات كريسبر القواعد.

Protocol

البروتوكول التالي هو مقتطف من Farboud وآخرون، تحرير الجينوم المحسن مع Cas9 Ribonucleoprotein في الخلايا والكائنات الحية المتنوعة، J. Vis. Exp. (2018).

1. جمعية RNP

1. تصميم التجربة في وقت مبكر، والحصول على جميع مكونات الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، والبروتين في وقت مبكر. كممر أول، جرب أحد الضوابط الإيجابية المدرجة في الجدول 1 واستخدم الكواشف التجارية الموضحة في جدول المواد لضمان تصميم تجريبي موثوق وسلامة المواد. للحصول على نصائح إضافية حول التخطيط لتجربة جديدة لتحرير الجينوم، راجع الأوراق حول هذا الموضوع.
   ملاحظة: وبمجرد تجميعها كما هو موضح في الخطوات اللاحقة، يمكن تخزين RNPs المعدة مسبقا عند -80 درجة مئوية.
   1. بعد اختيار الجين الذي لاستهداف، واستخدام واحدة من الأدوات على الانترنت مجانا لتصميم gRNA الأمثل. تأكد من استهداف exon إذا كان يأمل في توليد خروج المغلوب.
      ملاحظة: ستساعد هذه الأدوات على تحديد موقع مستهدف مع تسلسل S. pyogenes PAM المجاور ، ودرجة عالية الجودة ، ودرجة منخفضة خارج الهدف.
   2. تنقية البروتين Cas9 S. pyogenes من خلال الأساليب المنشورة أو شرائه من بائع تجاري.
   3. إعداد العازلة Cas9 نموذجي لتخفيف الحمض النووي الريبي، وإعداد RNP، وتخزين البروتين، والذي يحتوي على 20 mM من درجة الحموضة HEPES 7.5، 150 mM من KCl، 10٪ الجلسرين، و 1 mM من TCEP. استخدم دائما المياه الخالية من النيوكليز في المخازن المؤقتة التي سيتم استخدامها لإعادة إنفاق أو تمييع الحمض النووي الريبي لمنع التدهور.
   4. إنتاج دليل الجيش الملكي النيبالي (tracrRNA وcrRNA أو sgRNA) من خلال النسخ في المختبر باستخدام الأساليب المنشورة، أو شرائه من شركة تخليق الحمض النووي.
   5. إذا كان إدراج الجينات، توليف أو شراء قالب الحمض النووي المانحة.
   6. تخزين البروتين ورنا aliquots في -80 درجة مئوية وتذوب على الجليد مباشرة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: كل تجميد ذوبان يقلل قليلا من الكفاءة. وتتوفر في أماكن أخرى بروتوكولات مفصلة ومفتوحة الوصول لتنقية Cas9 والنسخ المختبري للسغرناس.
2. RNP الإعدادية لC. تحرير elegans: تجميع مجمع RNP عن طريق إضافة الكواشف التالية من أجل إنشاء حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر (تتم الإشارة إلى التركيزات النهائية بين قوسين): Cas9 (2 ميكرومتر)، HEPES pH 7.5 (10 ميكرومتر)، KCl (115 ميكرومتر) ، crRNA (12 ميكرومتر) ، tracrRNA (40 ميكرومتر) ، وقوالب الإصلاح إذا لزم الأمر (0.5 ميكرومتر ssDNA أو ما يصل إلى 350 نانوغرام / ميكرولتر dsDNA).
   ملاحظة: كفاءة إصلاح نموذج DSB بوساطة Cas9 يتناسب مع تركيز بناء إصلاح dsDNA؛ وبالتالي، كلما زاد تركيز قالب الإصلاح، كلما كان الإصلاح القالب أكثر كفاءة. ومع ذلك ، فقد ثبت أن حقنة من الخلطات التي تحتوي على أكثر من 350 نانوغرام / ميكرولتر من dsDNA تقلل من صلاحية الديدان المحقونة. وبالتالي، فمن الأفضل استخدام ما يصل إلى، ولكن لا يزيد عن 350 نانوغرام / ميكرولتر من dsDNA في هذا المزيج لتحقيق أقصى قدر من كفاءة الإصلاح مع التقليل من فتكه.
   1. إضافة crRNAs متعددة لاستهداف loci متعددة في وقت واحد، حسب الحاجة لنهج الفحص المشترك CRISPR / التحويل المشترك. عند إضافة أكثر من crRNA واحد، إضافة كل تسلسليا إلى المزيج الرئيسي.
      ملاحظة: كمية كل crRNA لا تحتاج إلى أن تكون هي نفسها، وحتى مضاعفة التركيز الكلي للcrRNAs في المزيج الرئيسي دون تغيير تركيز Cas9 لا يبدو أن تتداخل مع وتيرة تولد في مكان معين. وترد أمثلة بالتفصيل في باييكس وآخرون.
   2. مزيج عن طريق pipetting وتدور حل RNP في 16000 × ز لمدة 5 ق لضمان أن يتم جمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.
   3. احتضان الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 15 متر.
   4. الطرد المركزي العينة في 16،000 × ز لمدة 1 دقيقة لبيليه أي الجسيمات التي يمكن أن تسد إبرة microinjection رقيقة بالملل. استخدام supernatant في الخطوات اللاحقة.
3. C. إعداد elegans

1. 1 قبل يوم من microinjection: إعداد منصات agarose للmicroinjection.

1. جعل 3٪ (ث / v) agarose الحل في الماء عن طريق إضافة agarose إلى الماء وجلب الحل ليغلي على لوحة ساخنة أو في الميكروويف.
2. ترتيب 24 ملم × 50 ملم × 1.5 مم تغطية الشرائح الزجاجية على طاولة واستخدام ماصة باستور الزجاج لوضع صغيرة (~ 15 ميكرولتر) قطرة من محلول الآجروز على الشريحة. تسطيح بسرعة انخفاض agarose عن طريق وضع غطاء آخر على القمة. السماح للgarose لترسيخ ومن ثم إزالة واحدة من coverlips.
3. اترك غطاء الأغطية المغلفة بالgarose وجها لوجه على سطح الطاولة بين عشية وضحاها حتى يجف. بعد 24 ساعة، تخزين منصات agarose في وعاء نظيف وجاف.
   ملاحظة: ويمكن استخدام هذه إلى أجل غير مسمى.

2. سحب الإبر microinjection: باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية borosilicate مع خيوط (القطر الخارجي 1.0 ملم وقطرها الداخلي 0.58 ملم)، وسحب الإبر على أساس ميلو والنار⁵⁷ وغيرها من الموارد. يمكن استخدام الإبر على الفور أو يمكن تخزينها في حاوية نظيفة وجافة ، استعدت بواسطة دعامات الطين.

3. للحفاظ على الديدان، وإعداد وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) أجار سكب في لوحات بيتري ورصدت مع البكتيريا OP50 (لبروتوكولات على معيار C. elegans الصيانة وصفات لوسائل الإعلام النمو، انظر Stiernagle).

4. المرحلة الديدان لmicroinjection: 12-24 ساعة قبل microinjection، واختيار hermaphrodites L4 على مراحل إلى لوحة جديدة NG-أجار مع البكتيريا OP50 واحتضانها بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية. لكل Cas9 الهدف / حقن مزيج، واختيار ~ 30 الديدان إلى لوحة.

4. يوم من microinjection: تحميل إبرة microinjection سحبت مع محلول RNP supernatant أعدت في الخطوة 1.2.
   1. ماصة فائقة من الخطوة 1.2.4 في ماصة شعرية سحبت والردم الحل من ماصة الشعرية في إبرة microinjection المعدة (تحميل عموما أقل من 0.1 ميكرولتر).
5. قم بتركيب الإبرة المحملة على جهاز الحقن المجهري المرفق بميكرومانيبولاتور. تعيين ضغط جهاز الحقن إلى 250 كيلو باسكال وضغط التوازن إلى 25 كيلو باسكال.
6. كسر مرة أخرى تلميح إبرة محملة لتوليد حافة إبرة حادة. وضع 15 ملم × 15 ملم × 1.5 مم coverslip مربع على الجزء العلوي من 24 ملم × 50 ملم × 1.5 ملم coverslip.
   1. تراكب حافة واحدة من coverlip مربع مع زيت الهالوكربون 700.
   2. ضع الإبرة في الزيت ، على حافة غطاء 15 ملم مربع.
   3. باستخدام اليد لتوجيه مرحلة المجهر وأغطية، فرشاة الشريحة صعودا وعلى طول حافة الإبرة في حين الاكتئاب دواسة الحقن / زر. كسر طرف الإبرة مرة أخرى، وزيادة تدفق السائل من الإبرة. تحقيق معدل التدفق الأمثل عن طريق جعل حقن مزيج تدفق على طول حافة الإبرة، وتشكيل ~ 1 فقاعة / ثانية.
7. تأكد من أن الديدان L4 التقطت 12-24 ساعة قبل microinjection يتم تنظيمها تنمويا الشباب البالغين في يوم الحقن. اختيار الديدان الشباب الكبار إلى لوحة NG-أجار التي تفتقر إلى البكتيريا OP50 والسماح لهم بالزحف حولها لمدة 5 دقائق. وهذا يقلل من كمية البكتيريا المنقولة إلى وسادة الحقن، وتقليل القباقيب إبرة.
8. وضع لوحة حقن agarose / coverslip على نطاق تشريح. باستخدام اختيار دودة، وضع مسار صغير من زيت الهالوكربون على طول حافة واحدة من لوحة.
9. باستخدام اختيار دودة المغلفة في النفط، ورفع العديد من الديدان قبالة لوحة NG-أجار وإلى مسار النفط. مع الشعر الناعم تعلق على ماصة، مثل رمش أو شعيرات القط، ووضع الديدان في موازاة ذلك، ودفع بلطف الديدان في لوحة agarose. حتى مريحة مع إجراء microinjection، جبل فقط وحقن دودة واحدة في وقت واحد.
   ملاحظة: سوف agarose الجافة الفتيل الرطوبة من الديدان، مما تسبب لهم على الانضمام إلى لوحة. وبالتالي ، يجب على المرء أن يعمل بسرعة كما يمكن للديدان الجفاف.
   1. مرة واحدة في الموقف وتعلق على لوحة، تراكب الديدان مع بضع قطرات أخرى من زيت الهالوكربون (~ 20 ميكرولتر) من غيض من اختيار دودة.
10. C. elegans غوند Microinjection مع RNPs والرعاية بعد الحقن
    تم تكييف بروتوكول الميكرويكشن من ميلو والنار ووصفها بالتفصيل في مكان آخر.
    1. ضع الغطاء مع الديدان المركبة على مجهر الحقن. تحت التكبير المنخفض (الهدف 5X ، 10X العين) ، ضع الديدان عموديا على إبرة الحقن.
       1. التبديل إلى التكبير عالية (40X الهدف، 10X العين)، وإعادة وضع الإبرة المجاورة للذراع الغدد الصماء المقابلة للمنطقة بالقرب من النوى في منتصف إلى أواخر pachytene.
       2. باستخدام micromanipulator، تحريك الإبرة ضد الدودة، والاكتئاب لطيف قليلا. ثم، بيد واحدة، اضغط على جانب مرحلة المجهر لهز الإبرة من خلال قطعة. الاكتئاب دواسة الحقن / زر وملء ببطء الذراع النخر مع مزيج الحقن وإزالة الإبرة.
       3. كرر هذه الخطوة مع ذراع النند الأخرى.
    2. بمجرد حقن الديدان ، قم بإزالة غطاء الغطاء / لوحة الآغاروز ووضعها تحت المجهر التشريحي.
       1. باستخدام ماصة شعرية سحبت، وتشريد النفط من الديدان عن طريق الأنابيب عازلة M9 عليها. إجراء هذا العلاج للافراج عن الديدان من أجار.
       2. بعد 10 دقائق ، عندما تسحق الديدان في المخزن المؤقت ، نقلها إلى لوحة NG-agar مع بكتيريا OP50 باستخدام ماصة الشعرية المنسحبة. ضع اللوحة عند 20 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة حتى تتعافى الديدان وتتحرك.
    3. بمجرد استردادها ، قم بنقل الديدان بشكل فردي إلى لوحات NG-agar باستخدام OP50 ونقل اللوحات إلى حاضنة 25 درجة مئوية.
    4. السماح للP₀حقن الديدان لتنمو ووضع ذرية لمدة 3 أيام. فحص ذرية F_1.
       1. إذا كنت تستخدم CRISPR أو التحويل المشترك ، ثم حدد الديدان المرشحة للفحص على أساس ما إذا كان لديهم النمط الظاهري المتحول للجين المرجعي. نقل هذه الديدان ملحوظ بشكل فردي إلى لوحات جديدة NG-أجار مع OP50 والسماح لهم لوضع ذرية F₂ في 20 درجة مئوية.
          ملاحظة: يجب أن يوفر النمط الظاهري المستخدم لفحص أو اختيار CRISPR المشترك تقديرا مبكرا لنجاح تحرير Cas9.
       2. إذا لم يكن النمط الظاهري المشترك CRISPR موجودا ، فاستئصال ميكرونجيد تحكم إيجابي للمساعدة في تحسين كفاءة التلقيح الدقيق.
          ملاحظة: على سبيل المثال، بما في ذلك البلازميد في مزيج الحقن الذي يشفر mCherry الموسومة MYO-2 سوف تساعد على تقييم كفاءة الحقن. الديدان حقن بنجاح مع pCFJ90 سيكون لها بعض النسل مع البلعوم الفلورسنت.
    5. فحص الديدان F₁ لوجود التعديلات المطلوبة. اختيار الأم F₁ إلى بئر الفردية من لوحة 96 جيدا، lyse لها، وفحص الحمض النووي لها إما عن طريق إدراج محددة PCR التضخيم، وتحليل تسلسل الحمض النووي، أو المقايسة نواة مساح (CEL-1).
       ملاحظة: يمكن إجراء هذه المقايسات عند استخدام التحويل المشترك CRISPR/المشارك أو أنظمة الفحص أو الاختيار الأخرى.

Representative Results

الجدول 1: ضوابط إيجابية للتجارب الأولية لتحرير الجينوم. يعرض هذا الجدول المعلومات الرئيسية اللازمة لإجراء تجربة تحرير الجينوم لأول مرة في كل من الخلايا والكائنات الحية الموصوفة في هذا البروتوكول. ومن المرجح أن يؤدي اتباع هذه المعلمات إلى نتيجة ناجحة يمكن استخدامها لاختبار البروتوكول أو كخط أساس للمقارنة بمجرد أن يستهدف المجرب جينا من مصلحته الخاصة. F: إلى الأمام، R: عكس، HDR: إصلاح موجهة homology. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar