戈纳德微注射：一种化合物输送方法，直接进入C.elegans的细菌线

Overview

该视频描述了微注射，一种创建转基因 C.elegans 菌株的常见方法。 在示例中，我们将看到用于引入核糖核蛋白 （RNP） 复合物用于 CRISPR 碱基因编辑的微注射。

Protocol

以下协议是法布德等人的摘录，增强基因组编辑与Cas9核糖核蛋白在不同的细胞和生物体，J.Vis.Exp.（2018年）。

1. RNP 大会

1. 提前设计实验，提前获取所有RNA、DNA和蛋白质成分。作为第一关，请尝试表 1 中列出的正控件之一，并使用材料表中描述的商业试剂，以确保可靠的实验设计和材料的完整性。有关规划新的基因组编辑实验的其他提示，请参阅有关此主题的论文。
   注：一旦按照后续步骤描述组装，提前准备的 RNP 可存储在 -80 °C。
   1. 在选择要瞄准哪个基因后，使用其中一个免费的在线工具来设计最佳的 gRNA。如果希望产生淘汰，请务必瞄准exon。
      注： 这些工具将有助于识别具有相邻的 S. pyogenes PAM 序列、高质量分数和低目标得分的目标站点。
   2. 通过已发布的方法净化S. pyogenes Cas9 蛋白质，或从商业供应商购买。
   3. 为RNA稀释、RNP制备和蛋白质储存准备一个典型的 Cas9 缓冲，其中包含 20 mM 的 HEPES pH 7.5、150 mM 的 KCl、10% 甘油和 1 mM 的 TCEP。始终在缓冲器中使用无核糖水，用于补充或稀释RNA以防止降解。
   4. 使用已发布的方法通过体外转录产生指南RNA（跟踪RNA和crRNA或sgRNA），或从核酸合成公司购买。
   5. 如果插入基因，则合成或购买捐赠者 DNA 模板。
   6. 将蛋白质和RNA单报价储存在-80°C，并在使用前立即在冰上解冻。
      注：每次冷冻都稍微降低了效率。有关 Cas9 净化和 sgRNA 体外转录的详细开放访问协议，可在其他地方找到。
2. C. elegans编辑的 RNP 准备：通过添加以下试剂组装 RNP 复合体，以创建最终体积为 20 μL（括号中注明最终浓度）：Cas9 （2 μM）、HEPES pH 7.5 （1） 0 μM）、KCl（115μM）、crRNA（12μM）、特拉克尔纳（40μM）和修复模板（如果需要则为0.5微米ssDNA或高达350 ng/μL dsDNA）。
   注：Cas9 介停的 DSB 模板修复的效率与 dsDNA 维修结构的集中度成正比：因此，修复模板的集中度越高，模板修复的效率就越高。然而，已证明注射含有大于350 ng/μL的dsDNA混合物可降低注射蠕虫的生存能力。因此，最好在混合中使用不超过 350 ng/μL 的 dsDNA，以最大限度地提高维修效率，同时最大限度地减少其杀伤力。
   1. 根据共同 CRISPR/共同转换筛选方法的需要，添加多个 crRNA 同时针对多个位置。当添加多个crNA时，按顺序将每个条件添加到主组合中。
      注：每个 crRNA 的量不需要相同，甚至在不改变 Cas9 浓度的情况下将主混合物中 crRNA 的总浓度增加一倍，似乎也不会干扰特定位置的突变频率。例如，在Paix等人中详细描述了这些例子。
   2. 通过管道混合，以 16，000 x g 的 5s 旋转 RNP 解决方案，以确保解决方案收集在管子底部。
   3. 在 37 °C 的 15 米下孵化溶液。
   4. 将样品以 16，000 x g 的浓度排入 1 分钟，以颗粒颗粒，这些颗粒物可能会堵塞薄薄的微注射针。在随后的步骤中使用超自然药物。
3. C. 埃莱甘斯 准备

1.微注射前1天：为微注射准备阿加罗斯垫。

1. 通过在水中加入蔗糖并将溶液放在热板或微波炉中煮沸，在水中制作 3% （w/v） 的糖溶液。
2. 将 24 mm x 50 mm x 1.5 mm 盖玻璃滑梯放在桌子上，然后使用玻璃巴斯德移液器将一小滴（~15μL）的蔗糖溶液放在滑梯上。通过在顶部放置另一个盖子，快速平整了糖滴。允许阿加罗斯凝固，然后删除其中一个盖片。
3. 将涂有糖衣的盖子正面朝上放在桌面过夜晾干。24 小时后，将蔗糖垫存放在干净干燥的容器中。
   注： 这些可以无限期地使用。

2. 拉微注射针：使用带细丝（外径1.0毫米，内径0.58毫米）的薄氧酸玻璃毛细毛，根据梅洛和Fire⁵⁷和其他资源拉针。针头可以立即使用，也可以储存在干净干燥的容器中，由粘土支架支撑。

3. 为了维护蠕虫，准备一个线虫生长介质 （NGM） agar 倒入培养皿板中，并发现 OP50 细菌（有关标准C. elegans维护的协议和生长介质配方，请参阅 Stiernagle）。

4. 将蠕虫用于微注射：在微注射前 12-24 小时，将 L4 级草药采摘到含有 OP50 细菌的新 NG-agar 板中，并在 20 °C 下连夜孵育。 对于每个 Cas9 靶点/注射组合，将 +30 蠕虫挑到盘子中。

4. 微注射日： 用步骤 1.2 中准备的 RNP 解决方案超自然加载拉微注射针。
   1. 从步骤 1.2.4 到拉毛细管移液器的超细管，并将溶液从毛细管移液回填到准备好的微注射针中（通常加载小于 0.1 μL）。
5. 将加载的针头安装到连接到微操纵器的微注射装置上。将注射装置压力设置为 250 kPa，将平衡压力设置为 25 kPa。
6. 打破加载的针尖，产生锋利的针边。将 15 mm x 15 mm x 1.5 mm 方形盖滑放在 24 mm x 50 mm x 1.5 mm 盖面的顶部。
   1. 用卤碳油 700 覆盖广场盖片的一个边缘。
   2. 将针头放在油中，位于 15 mm 方形盖滑的边缘。
   3. 用一只手引导显微镜阶段和盖片，刷滑动向上和沿针的边缘，同时压低注射踏板/按钮。将针尖向后折断，增加针头液体的流动。通过使注射混合沿着针的边缘向上流动，形成 +1 气泡/s，实现最佳流速。
7. 确认在微注射前12-24小时采摘的L4蠕虫在注射当天发育阶段。将年轻的成年蠕虫挑选到缺乏OP50细菌的NG-agar板上，并允许它们爬行5分钟。这减少了转移到注射垫的细菌数量，最大限度地减少了针块。
8. 将阿加罗斯注射垫/盖片放在解剖范围上。使用蠕虫采摘，沿着垫子的一边铺设一小条卤素油轨道。
9. 使用涂有油的蠕虫采摘，将几只蠕虫从NG-agar板上抬起来，并进入油的轨道。将细细的头发附着在移液器上，如睫毛或猫须，将蠕虫平行放置，轻轻地将蠕虫推入阿加罗斯垫。在适应微注射程序之前，每次只能安装并注射一只蠕虫。
   注：干燥的糖将吸附蠕虫的水分，导致它们粘在垫子上。因此，一个人必须迅速工作，因为蠕虫可以干燥。
   1. 一旦到位并连接到垫子上，从蠕虫采摘的尖端再用几滴卤碳油（~20 μL）覆盖蠕虫。
10. C. 埃莱甘斯 · 戈纳德微注射与 Rnps 和注射后护理
    微注射协议改编自梅洛和火，并在其他地方详细描述。
    1. 将带安装蠕虫的盖片放在注射显微镜上。在低倍率（5倍目标，10倍眼）下，将蠕虫垂直于注射针。
       1. 切换到高倍增度（40倍目标，10倍眼），重新定位针头相邻的性腺手臂对应于核附近的区域在中后期帕奇特内。
       2. 使用微脉冲器，将针头移到蠕虫上，稍微压碎角质层。然后，用一只手轻点显微镜舞台的一侧，将针头穿过皮质层。压低注射踏板/按钮，慢慢用注射混合填充性腺手臂并取出针头。
       3. 用另一个性腺手臂重复此步骤。
    2. 注射蠕虫后，取出盖片/糖垫，放在解剖显微镜下。
       1. 使用拉毛细管移液器，通过在蠕虫身上管道 M9 缓冲器来取代蠕虫的油。执行此处理以释放来自阿加的蠕虫。
       2. 10分钟后，当蠕虫在缓冲区中四处游荡时，使用拉毛细管移液器将它们移到带有OP50细菌的NG-agar板上。将盘子放在20°C的2-3小时，直到蠕虫已经恢复并四处走动。
    3. 恢复后，将蠕虫单独转移到带有 OP50 的 NG-agar 板中，并将板转移到 25 °C 孵化器。
    4. 允许P₀注射蠕虫生长和奠定后代3天。筛选 F₁ 后代。
       1. 如果使用联合CRISPR或共同转换，然后根据候选蠕虫是否有参考基因的突变表型进行筛选。单独将这些标记的蠕虫转移到带有 OP50 的新 NG-agar 板中，并允许它们在₂₀ °C 下放置 F 2 后代。
          注： 用于共同 CRISPR 筛选或选择的表型应为 Cas9 编辑的成功提供早期估计。
       2. 如果不存在共CRISPR表型，微注入正控制质粒，以帮助提高微注射效率。
          注： 例如，在注射组合中包括编码 mCherry 标记的 MYO-2 中的质粒，将有助于评估注射效率。成功注射pCFJ90的蠕虫将有一些后代与荧光噬菌体。
    5. 检查 F₁蠕虫是否存在所需的编辑。将 F₁母亲挑到 96 井板的单独井中，对她进行解析，并通过插入特定的 PCR 放大、DNA 序列分析或测量员核糖酶检测 （CEL-1） 来检查她的 DNA。
       注： 使用共同 CRISPR/共同转换或其他筛选或选择制度时，可以执行这些检测。

Representative Results

表1：初步基因组编辑实验的正控制。此表显示了在本协议中描述的每个细胞和生物体中执行首次基因组编辑实验所需的关键信息。遵循这些参数可能会产生一个成功的结果，可用于测试协议或作为比较的基线，一旦实验者瞄准自己感兴趣的基因。F： 前进， R： 反向， HDR： 同源定向修复. 请单击此处查看此表的较大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar