Gonad Microinjection: En metode til sammensat levering direkte ind i kimen af C. elegans

Overview

Denne video beskriver microinjection, en fælles metode til at skabe transgene C. elegans stammer.  I eksemplet vil vi se microinjection bruges til at introducere et ribonukleoprotein (RNP) kompleks til CRISPR-baser genredigering.

Protocol

Følgende protokol er et uddrag fra Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018).

1. RNP Forsamling

1. Design eksperimentet i god tid, og anskaffe alle RNA-, DNA- og proteinkomponenter på forhånd. Som et første gennemløb kan du prøve en af de positive kontroller, der er anført i tabel 1, og anvende de kommercielle reagenser, der er beskrevet i materialeoversigten, for at sikre et pålideligt eksperimentelt design og materialernes integritet. For yderligere tips om planlægning af et nyt genom-redigering eksperiment, se papirer om dette emne.
   BEMÆRK: Når de er samlet som beskrevet i de efterfølgende trin, kan RNP'er, der er forberedt på forhånd, opbevares ved -80 °C.
   1. Når du har valgt, hvilket gen der skal målrettes, skal du bruge et af de gratis online værktøjer til at designe et optimalt gRNA. Sørg for at målrette en exon, hvis du håber at generere en knockout.
      BEMÆRK: Disse værktøjer hjælper med at identificere et målsted med en tilstødende S. pyogenes PAM-sekvens, score af høj kvalitet og lav score uden for målet.
   2. Rense S. pyogenes Cas9 protein gennem offentliggjorte metoder eller købe det fra en kommerciel leverandør.
   3. Forbered en typisk Cas9-buffer til RNA-fortynding, RNP-præparat og proteinlagring, som indeholder 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10% glycerol og 1 mM TCEP. Brug altid nukleasefrit vand i buffere, der vil blive brugt til at genbruge eller fortynde RNA for at forhindre nedbrydning.
   4. Fremstil vejledningen RNA (tracrRNA og crRNA eller sgRNA) gennem en in vitro transskription ved hjælp af offentliggjorte metoder, eller køb den fra en nukleinsyresyntesevirksomhed.
   5. Hvis du indsætter et gen, syntetiserer eller køber en donor-DNA-skabelon.
   6. Proteinet og RNA-aliquoterne opbevares ved -80 °C og tøes på is umiddelbart før brug.
      BEMÆRK: Hver fryse-optø lidt sænker effektiviteten. Detaljerede protokoller med åben adgang til Cas9-rensning og in vitro-transskription af sgRNA'er er tilgængelige andre steder.
2. RNP prep til C. elegans-redigering: Saml RNP-komplekset ved at tilføje følgende reagenser for at skabe et endeligt volumen på 20 μL (de endelige koncentrationer er noteret i parentes): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) og reparationsskabelonerne, hvis det er nødvendigt (0,5 μM ssDNA eller op til 350 ng/μL dsDNA).
   BEMÆRK: Effektiviteten af en Cas9-medieret DSB-skabelon reparation er proportional med koncentrationen af dsDNA reparationskonstruktionen; Jo højere koncentrationen af reparationsskabelonen er, jo mere effektiv er den skabelonreparation. En injektion af blandinger, der indeholder mere end 350 ng/μL dsDNA, har imidlertid vist sig at reducere levedygtigheden af de injicerede orme. Således er det bedst at bruge op til, men ikke mere end 350 ng / μL dsDNA i blandingen for at maksimere reparationseffektiviteten og samtidig minimere dens dødelighed.
   1. Tilføj flere crRNA'er for at målrette mod flere loci samtidigt efter behov for co-CRISPR/co-conversion screening tilgang. Når du tilføjer mere end ét crRNA, skal du føje hver enkelt sekventielt til mastermikset.
      BEMÆRK: Mængden af hver crRNA behøver ikke at være den samme, og selv en fordobling af den samlede koncentration af crRNA'er i masterblandingen uden at ændre koncentrationen af Cas9 synes ikke at forstyrre hyppigheden af mutagenese ved et bestemt locus. Eksemplerne er beskrevet i detaljer i Paix et al.
   2. Bland ved pipetting og drej RNP-opløsningen ved 16.000 x g i 5 s for at sikre, at opløsningen opsamles i bunden af røret.
   3. Opløsningen inkuberes ved 37 °C i 15 m.
   4. Centrifuge prøven ved 16.000 x g i 1 min. for at pellet eventuelle partikler, der kunne tilstoppe den tyndborede mikroinjection nål. Brug supernatanten i de efterfølgende trin.
3. C. elegans Forberedelse

1. 1 dag før mikroinjection: Forbered agarose puder til mikroinjection.

1. Lav en 3% (w/ v) agaroseopløsning i vand ved at tilsætte agarose til vand og bringe opløsningen i kog på en kogeplade eller i en mikrobølgeovn.
2. Arranger 24 mm x 50 mm x 1,5 mm dækglasrutsjebaner på et bord, og brug en glas pasteurpipette til at placere en lille (~15 μL) dråbe agaroseopløsning på rutsjebanen. Hurtigt flade agarose dråbe ved at placere en anden coverslip på toppen. Lad agarose at størkne og derefter fjerne en af de coverslips.
3. Lad den agarosebelagte coverslip med billedsiden nedad på en bordplade natten over tørre. Efter 24 timer opbevares agarosepuderne i en ren, tør beholder.
   BEMÆRK: Disse kan bruges på ubestemt tid.

2. Træk i mikroinjektionsnålene: Træk nålene på basis af Mello og Fire 57 og andre ressourcer ved hjælp af borosilicateglaskapillærer med filamenter (ydre diameter 1,0 mm og indvendig diameter^0,58 mm). Nålene kan bruges med det samme eller kan opbevares i en ren, tør beholder, afstivet af lerstøtter.

3. For vedligeholdelse af orme, forberede en Nematode Growth Media (NGM) agar hældes i Petri plader og spottet med OP50 bakterier (for protokoller på standard C. elegans vedligeholdelse og opskrifter på vækst medier, se Stiernagle).

4. Indspil ormene til mikroinjektion: 12-24 timer før mikroinjektionen, vælg L4-iscenesatte hermafroditter til en ny NG-agar plade med OP50 bakterier og inkuber dem natten over ved 20 °C. For hver Cas9 mål / injektion mix, pick ~ 30 orme til pladen.

4. Dag med mikroinjection: Lad den trukket mikroinjection nål med RNP opløsning supernatant udarbejdet i trin 1.2.
   1. Supernatanten pipetteres fra trin 1.2.4 til en trukket kapillærpipette, og opløsningen fra kapillærpipetten fyldes op i den forberedte mikroinjektionsnål (lastes normalt mindre end 0,1 μL).
5. Monter den indlæste nål på mikroinjektionsapparatet, der er fastgjort til en mikromanipulator. Sæt indsprøjtningsapparatets tryk til 250 kPa og balancetrykket til 25 kPa.
6. Bryd den indlæste nålspids tilbage for at generere en skarp nålekant. Placer en 15 mm x 15 mm x 1,5 mm firkantet coverlip på toppen af en 24 mm x 50 mm x 1,5 mm coverslip.
   1. Overlejr den ene kant af den firkantede coverlip med halocarbonolie 700.
   2. Placer nålen i olien, ved kanten af den 15 mm firkantede coverlip.
   3. Brug en hånd til at styre mikroskopet fase og coverlip, børste dias op og langs kanten af nålen, mens deprimerende injektion pedal / knap. Bryd nålespidsen tilbage, hvilket øger strømmen af væsken ud af nålen. Opnå en optimal strømningshastighed ved at få injektionsblandingen til at flyde op langs kanten af nålen og danne ~1 boble/s.
7. Bekræft, at L4 orme plukket 12-24 timer før mikroinjection er udviklingsmæssigt iscenesat unge voksne på injektionsdagen. Vælg de unge voksne orme til en NG-agar plade, der mangler OP50 bakterier og give dem mulighed for at kravle rundt i 5 min. Dette reducerer mængden af bakterier overført til injektion pad, minimere nål træsko.
8. Placer en agarose injektion pad / coverslip på en dissektion omfang. Brug en orm pick, lægge et lille spor af halocarbon olie langs den ene kant af puden.
9. Brug ormen pick belagt med olie, løfte flere orme fra NG-agar plade og ind i sporet af olie. Med et fint hår fastgjort til en pipette, såsom en øjenvipper eller kat whisker, skal du placere ormene parallelt og forsigtigt skubbe ormene ind i agarosepuden. Indtil det er behageligt med mikroinjektionsproceduren, skal du kun montere og injicere en orm ad gangen.
   BEMÆRK: Den tørre agarose vil væge fugten fra ormene, hvilket får dem til at klæbe til puden. Derfor må man arbejde hurtigt, da ormene kan udtørre.
   1. Når ormene er på plads og fastgjort til puden, overlejres de med endnu et par dråber halocarbonolie (~20 μL) fra spidsen af ormens pluk.
10. C. elegans Gonad Microinjection med RNPs og Post-injektion Care
    Mikroinjection protokollen er tilpasset fra Mello og Fire og beskrevet i detaljer andre steder.
    1. Placer coverlip med de monterede orme på injektion mikroskop. Under en lav forstørrelse (5X mål, 10X okulær), placere ormene vinkelret på injektion nålen.
       1. Skift til en høj forstørrelse (40X mål, 10X okulær), flyt nålen ved siden af gonadarmen svarende til regionen nær kernerne i midten til slutningen af pachyten.
       2. Brug mikromanipulatoren til at flytte nålen mod ormen og deprimere neglebåndet lidt. Tryk derefter på siden af mikroskopstadiet med den ene hånd for at ryste nålen gennem neglebåndet. Tryk på indsprøjtningspedalen/-knappen, og fyld langsomt gonadarmen med injektionsblandingen, og fjern nålen.
       3. Gentag dette trin med den anden gonad arm.
    2. Når ormene er injiceret, skal du fjerne coverslip / agarose pad og placere den under et dissekerende mikroskop.
       1. Ved hjælp af en trukket kapillær pipette, fortrænge olien fra ormene ved pipetter en M9 buffer over dem. Udfør denne behandling for at frigive ormene fra agaren.
       2. Efter 10 min, når ormene er prygl rundt i bufferen, flytte dem til en NG-agar plade med OP50 bakterier ved hjælp af trukket kapillær pipette. Pladen anbringes ved 20 °C i 2-3 timer, indtil ormene er kommet sig og bevæger sig rundt.
    3. Når ormene er genvundet, overføres de individuelt til NG-agar-plader med OP50, og pladerne overføres til en inkubator på 25 °C.
    4. Lad P_0-injiceredeorme vokse og lægge afkom i 3 dage. Screen F₁ afkom.
       1. Hvis du bruger co-CRISPR eller co-konvertering, skal du vælge kandidatormene til screening baseret på, om de har referencegenets mutante fænotype. Individuelt overføre disse mærkede orme til nye NG-agar plader med OP50 og give dem mulighed for at lægge F₂ afkom ved 20 °C.
          BEMÆRK: Den fænotype, der anvendes til en co-CRISPR-screening eller -udvælgelse, bør give et tidligt skøn over Cas9-redigeringens succes.
       2. Hvis co-CRISPR-fænotypen ikke er til stede, skal du mikroinjektere et positivt kontrolplasmid for at hjælpe med at forbedre mikroinjektionseffektiviteten.
          BEMÆRK: For eksempel, herunder et plasmid i injektionsblandingen, der koder mCherry-mærket MYO-2, vil hjælpe med at vurdere injektionseffektiviteten. Orme med succes injiceres med pCFJ90 vil have nogle afkom med fluorescerende svælg.
    5. Undersøg F₁ ormene for tilstedeværelsen af de ønskede redigeringer. Vælg F₁ mor til en individuel brønd af en 96-godt plade, lyse hende, og undersøge hendes DNA ved enten indsætte-specifikke PCR forstærkning, DNA-sekvens analyse, eller landmåler nuklease assay (CEL-1).
       BEMÆRK: Disse assays kan udføres, når du bruger en co-CRISPR/co-conversion eller andre screenings- eller udvælgelsesordninger.

Representative Results

Tabel 1: Positiv kontrol med foreløbige genomredigeringseksperimenter. Denne tabel viser de vigtigste oplysninger, der er nødvendige for at udføre et første gangs genomredigeringseksperiment i hver af de celler og organismer, der er beskrevet i denne protokol. Efter disse parametre vil sandsynligvis give et vellykket resultat, der kan bruges til at teste protokollen eller som en baseline til sammenligning, når eksperimentatoren er rettet mod et gen af deres egen interesse. F: fremad, R: omvendt, HDR: homologi-rettet reparation. Klik her for at se en større version af denne tabel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar