Gonad Microinjection: Een methode van samengestelde levering direct in de kiembaan van C. elegans

Overview

Deze video beschrijft micro-injection, een veelgebruikte methode om transgene C. elegans stammen te creëren.  In het voorbeeld zien we micro-injection gebruikt om een ribonucleoproteïne (RNP) complex voor CRISPR-bases genbewerking te introduceren.

Protocol

Het volgende protocol is een fragment uit Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018).

1. RNP-vergadering

1. Ontwerp het experiment ruim van tevoren en verwerft alle RNA-, DNA- en eiwitcomponenten van tevoren. Probeer als eerste een van de positieve controles in tabel 1 en gebruik de commerciële reagentia die in de tabel met materialen worden beschreven om een betrouwbaar experimenteel ontwerp en de integriteit van de materialen te garanderen. Zie artikelen over dit onderwerp voor meer tips over het plannen van een nieuw genoombewerkingsexperiment.
   OPMERKING: Eenmaal gemonteerd zoals beschreven in de volgende stappen, kunnen RNPs die van tevoren zijn voorbereid, worden opgeslagen bij -80 °C.
   1. Nadat u hebt gekozen welk gen u wilt targeten, gebruikt u een van de gratis online tools om een optimaal gRNA te ontwerpen. Zorg ervoor dat je een exon target als je hoopt een knock-out te genereren.
      OPMERKING: Deze tools helpen bij het identificeren van een doellocatie met een aangrenzende S. pyogenes PAM-reeks, hoogwaardige score en lage off-target score.
   2. Zuiver het S. pyogenes Cas9-eiwit via gepubliceerde methoden of koop het bij een commerciële verkoper.
   3. Bereid een typische Cas9-buffer voor de RNA-verdunning, RNP-bereiding en eiwitopslag, die 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10% glycerol en 1 mM TCEP bevat. Gebruik nucleasevrij water altijd in buffers die worden gebruikt om RNA te resuspenderen of te verdunnen om afbraak te voorkomen.
   4. Produceer de gids RNA (tracrRNA en crRNA of sgRNA) via een in vitro transcriptie met behulp van gepubliceerde methoden, of koop het bij een nucleïnezuursynthesebedrijf.
   5. Als u een gen invoegt, synthetiseert of koopt u een donor-DNA-sjabloon.
   6. Bewaar de eiwitten en RNA-aliquots bij -80 °C en ontdooi direct voor gebruik op ijs.
      OPMERKING: Elke vries-dooi verlaagt de efficiëntie iets. Gedetailleerde, open-access protocollen voor Cas9 zuivering en de in vitro transcriptie van sgRNAs zijn elders beschikbaar.
2. RNP voorbereiding voor C. elegans editing: Assembleer het RNP-complex door de volgende reagentia toe te voegen om een eindvolume van 20 μL te creëren (de uiteindelijke concentraties worden tussen haakjes genoteerd): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) en de reparatiesjablonen indien nodig.
   OPMERKING: De efficiëntie van een Cas9-gemedieerde DSB-gemodelleerde reparatie is evenredig met de concentratie van de dsDNA-reparatieconstructie; dus, hoe hoger de concentratie van de reparatiesjabloon, hoe efficiënter de gesjabloonde reparatie. Het is echter aangetoond dat een injectie van mengsels die meer dan 350 ng/μL dsDNA bevatten, de levensvatbaarheid van de geïnjecteerde wormen vermindert. Het is dus het beste om tot, maar niet meer dan 350 ng/ μL dsDNA in de mix te gebruiken om de reparatie-efficiëntie te maximaliseren en tegelijkertijd de dodelijkheid ervan te minimaliseren.
   1. Voeg meerdere crRNAs toe om meerdere loci tegelijkertijd te targeten, indien nodig voor de co-CRISPR/co-conversie screening aanpak. Wanneer u meer dan één crRNA toevoegt, voegt u elk opeenvolgend toe aan de hoofdmix.
      OPMERKING: De hoeveelheid crRNA hoeft niet hetzelfde te zijn, en zelfs een verdubbeling van de totale concentratie crRNAs in het hoofdmengsel zonder de concentratie van Cas9 te veranderen, lijkt de frequentie van mutagenese op een specifieke locatie niet te verstoren. Voorbeelden worden in detail beschreven in Paix et al.
   2. Meng door de RNP-oplossing te pipetten en draai gedurende 5 s op 16.000 x g om ervoor te zorgen dat de oplossing aan de onderkant van de buis wordt verzameld.
   3. Incubeer de oplossing bij 37 °C gedurende 15 m.
   4. Centrifugeer het monster gedurende 1 minuut op 16.000 x g om deeltjes te pelleteren die de dun verveelde micro-injectienaald kunnen verstoppen. Gebruik het supernatant in de volgende stappen.
3. C. elegans Voorbereiding

1. 1 dag voorafgaand aan micro-injection: Bereid de agarose pads voor de micro-injection.

1. Maak een 3% (w/v) agarose oplossing in water door agarose aan water toe te voegen en de oplossing aan de kook te brengen op een hete plaat of in een magnetron.
2. Plaats glazen dia's van 24 mm x 50 mm x 1,5 mm op een tafel en gebruik een glazen Pasteurpipet om een kleine (~ 15 μL) druppel agarose-oplossing op de glijbaan te plaatsen. Maak de agarose drop snel plat door er nog een coverlip op te plaatsen. Laat de agarose stollen en verwijder vervolgens een van de coverslips.
3. Laat de met agarose beklede hoezen 's nachts met de voorkant naar boven op een tafelblad drogen. Bewaar de agarose pads na 24 uur in een schone, droge container.
   OPMERKING: Deze kunnen voor onbepaalde tijd worden gebruikt.

2. Trek aan de micronaalden: gebruik borosilicaatglas haarvaten met filamenten (buitendiameter 1,0 mm en binnendiameter 0,58 mm), trek aan de naalden op basis van Mello en Fire⁵⁷ en andere middelen. De naalden kunnen direct worden gebruikt of kunnen worden opgeslagen in een schone, droge container, gebeugeld door kleisteunen.

3. Voor het onderhoud van de wormen, bereid een Nematode Growth Media (NGM) agar gegoten in Petri platen en gespot met OP50 bacteriën (voor protocollen op standaard C. elegans onderhoud en recepten voor groeimedia, zie Stiernagle).

4. Faseer de wormen voor micro-injection: 12-24 uur voorafgaand aan de micro-injection, pluk L4-geënsceneerde hermafrodieten naar een nieuwe NG-agar plaat met OP50 bacteriën en incubeer ze 's nachts bij 20 °C. Kies voor elke Cas9-doel-/injectiemix ~ 30 wormen op de plaat.

4. Dag van micro-injection: Laad de getrokken micro-injectienaald met de RNP-oplossing supernatant bereid in stap 1.2.
   1. Pipet de supernatant vanaf stap 1.2.4 in een getrokken capillaire pipet en vul de oplossing van de capillaire pipet op in de voorbereide micro-injectienaald (over het algemeen minder dan 0,1 μL laden).
5. Monteer de geladen naald op het micro-injectieapparaat dat aan een micromanipulator is bevestigd. Stel de druk van het injectieapparaat in op 250 kPa en de balansdruk op 25 kPa.
6. Breek de geladen naaldpunt terug om een scherpe naaldrand te genereren. Plaats een vierkante afdeklip van 15 mm x 15 mm x 1,5 mm op de bovenkant van een afdeklip van 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
   1. Belaag een rand van de vierkante hoezenlip met halocarbonolie 700.
   2. Plaats de naald in de olie, aan de rand van de vierkante afdeklip van 15 mm.
   3. Gebruik een hand om het microscoopstadium en de deklip te begeleiden en borstel de schuif omhoog en langs de rand van de naald terwijl u het injectiepedaal / de knop indrukt. Breek de punt van de naald terug, waardoor de vloeistofstroom uit de naald toeneemt. Bereik een optimaal debiet door de injectiemix langs de rand van de naald omhoog te laten stromen en ~1 bel/s te vormen.
7. Bevestig dat de L4-wormen die 12-24 uur vóór micro-injectie zijn geplukt, ontwikkelingsgerichte jongvolwassenen zijn op de dag van injectie. Pluk de jongvolwassen wormen op een NG-agar plaat zonder OP50 bacteriën en laat ze 5 minuten rondkruipen. Dit vermindert de hoeveelheid bacteriën die naar het injectiekussen worden overgebracht, waardoor naaldklompen worden geminimaliseerd.
8. Plaats een agarose injectiekussen/coverslip op een dissectiebereik. Leg met behulp van een wormpriem een klein spoor van halokoolstofolie langs één rand van de pad.
9. Til met behulp van de wormpriem bedekt met olie verschillende wormen van de NG-agar-plaat en in het spoor van olie. Met een fijn haar bevestigd aan een pipet, zoals een wimper of kattenharen, plaatst u de wormen parallel en duwt u de wormen voorzichtig in de agarose pad. Totdat u vertrouwd bent met de micro-injectieprocedure, monteert en injecteert u slechts één worm tegelijk.
   OPMERKING: De droge agarose zal het vocht van de wormen afvoeren, waardoor ze zich aan de pad hechten. Bijgevolg moet men snel werken omdat de wormen kunnen uitdrogen.
   1. Eenmaal in positie en bevestigd aan de pad, bedekt u de wormen met nog een paar druppels halocarbonolie (~ 20 μL) vanaf de punt van de wormpriem.
10. C. elegans Gonad Microinjection met RNPs en Post-injection Care
    Het micro-injection protocol is aangepast van Mello en Fire en elders in detail beschreven.
    1. Plaats de afdeklip met de gemonteerde wormen op de injectiemicroscoop. Plaats de wormen onder een lage vergroting (5X objectief, 10X oculaire) loodrecht op de injectienaald.
       1. Schakel over op een hoge vergroting (40X objectief, 10X oculaire), herpositioneer de naald naast de gonadearm die overeenkomt met het gebied bij de kernen in het midden tot laat-pachytene.
       2. Beweeg de naald met behulp van de micromanipulator tegen de worm en druk de nagelriem iets in. Tik vervolgens met één hand op de zijkant van het microscoopstadium om de naald door de nagelriem te bewegen. Druk het injectiepedaal/de knop in en vul de gonadearm langzaam met de injectiemix en verwijder de naald.
       3. Herhaal deze stap met de andere geslachtsarm.
    2. Zodra de wormen zijn geïnjecteerd, verwijdert u de coverslip/agarose pad en plaatst u deze onder een ontledende microscoop.
       1. Gebruik een getrokken capillaire pipet en verplaats de olie van de wormen door er een M9-buffer overheen te steken. Voer deze behandeling uit om de wormen uit de agar te bevrijden.
       2. Na 10 minuten, wanneer de wormen in de buffer rondslingeren, verplaatst u ze naar een NG-agar-plaat met OP50-bacteriën met behulp van de getrokken capillaire pipet. Plaats de plaat 2-3 uur op 20 °C totdat de wormen zich hebben hersteld en bewegen.
    3. Eenmaal hersteld, breng de wormen individueel over naar NG-agar-platen met OP50 en breng de platen over naar een incubator van 25 °C.
    4. Laat de P_{0-geïnjecteerde}wormen groeien en leg nakomelingengedurende 3 dagen. Screen de F₁ nakomelingen.
       1. Als u co-CRISPR of coconversie gebruikt, selecteert u de kandidaat-wormen voor screening op basis van de vraag of ze het mutante fenotype van het referentiegen hebben. Breng deze gemarkeerde wormen individueel over naar nieuwe NG-agarplaten met OP50 en laat ze F_{2-nakomelingen} op 20 °C leggen.
          OPMERKING: Het fenotype dat wordt gebruikt voor een co-CRISPR-screening of -selectie moet een vroege schatting geven voor het succes van Cas9-bewerking.
       2. Als het co-CRISPR-fenotype niet aanwezig is, moet u een positieve controleplasmide gebruiken om de micro-injectie-efficiëntie te verbeteren.
          OPMERKING: Bijvoorbeeld, het opnemen van een plasmide in de injectiemix die codeert voor mCherry-gelabelde MYO-2 zal helpen bij het beoordelen van de injectie-efficiëntie. Wormen die met succes met pCFJ90 worden geïnjecteerd, krijgen nakomelingen met fluorescerende farynxen.
    5. Controleer de F_1-wormen op de aanwezigheid van de gewenste bewerkingen. Kies de F_1-moeder uit een individuele put van een 96-putplaat, lyse haar, en onderzoek haar DNA door middel van insert-specifieke PCR-versterking, DNA-sequentieanalyse of surveyor nuclease-test (CEL-1).
       OPMERKING: Deze test kan worden uitgevoerd bij gebruik van een co-CRISPR/co-conversie of andere screening- of selectieregimes.

Representative Results

Tabel 1: Positieve controles voor voorlopige genoombewerkingsexperimenten. Deze tabel toont de belangrijkste informatie die nodig is om een eerste genoombewerkingsexperiment uit te voeren in elk van de cellen en organismen die in dit protocol worden beschreven. Het volgen van deze parameters zal waarschijnlijk een succesvol resultaat opleveren dat kan worden gebruikt om het protocol te testen of als basislijn voor vergelijking zodra de experimenteerder zich richt op een gen van hun eigen belang. F: vooruit, R: achteruit, HDR: homologie-gerichte reparatie. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar