ゴナドマイクロインジェクション:C.エレガンスの生殖細胞に直接化合物送達する方法

Overview

このビデオでは、トランスジェニック C.エレガン 株を作成する一般的な方法であるマイクロインジェクションについて説明します。 例では、CRISPR塩基遺伝子編集用のリボヌクレオプロテイン(RNP)複合体を導入するために使用されるマイクロインジェクションが見られます。

Protocol

以下のプロトコルは、Farboudらからの抜粋であり、多様な細胞および生物におけるCas9リボヌクレオタンパク質による強化されたゲノム編集、J.Vis. Exp. (2018)

1. RNP アセンブリ

1. 事前に実験を設計し、すべてのRNA、DNA、タンパク質成分を事前に取得します。最初のパスとして、表1に示されている正のコントロールのいずれかを試し、材料表に記載されている市販の試薬を使用して、信頼性の高い実験計画と材料の完全性を確保します。新しいゲノム編集実験の計画に関するその他のヒントについては、このトピックに関する論文を参照してください。
   注:以降のステップで説明したように組み立てたら、予め準備したRnpsは−80°Cで保存されてもよい。
   1. ターゲットとする遺伝子を選択した後、無料のオンラインツールの1つを使用して最適なgRNAを設計します。ノックアウトを生成したい場合は、必ずエキソンをターゲットにしてください。
      注: これらのツールは、隣接するS.pyogenes PAMシーケンス、高品質スコア、および低いオフターゲットスコアを持つターゲット部位を識別するのに役立ちます。
   2. 公開された方法を通じてS.pyogenes Cas9タンパク質を精製するか、商業ベンダーから購入してください。
   3. RNA希釈、RNP調製、タンパク質貯蔵用の典型的なCas9バッファーを調製し、20mMのHEPES pH 7.5、150mMのKCl、10%グリセロール、および1 mMのTCEPを含みます。分解を防ぐためにRNAを再中断または希釈するために使用されるバッファーには、必ずヌクレアーゼを含まない水を使用してください。
   4. パブリッシュされた方法を使用してインビトロ転写を介してガイドRNA(tracrRNAおよびcrRNAまたはsgRNA)を製造するか、核酸合成会社から購入する。
   5. 遺伝子を挿入する場合は、ドナーDNAテンプレートを合成または購入します。
   6. タンパク質とRNAアリコートを-80°Cに保存し、使用直前に氷の上で解凍してください。
      注:各凍結融解は、効率をわずかに低下させます。Cas9精製用の詳細なオープンアクセスプロトコルとsgRNAのインビトロ転写は、他の場所で入手可能です。
2. CのためのRNP準備。 エレガンス編集:20 μLの最終容積を作成するために、次の試薬を添加してRNP複合体を組み立てます(最終濃度は括弧内に記載されています):Cas9(2 μM)、HEPES pH 7.5(10 μ) KCl (115 μM)、crRNA(12 μM)、トラクRNA(40 μM)、および必要に応じて修復テンプレート(0.5 μM ssDNAまたは最大350 ng/μL dsDNA)。
   注:Cas9媒介DSBテンプレート修復の効率は、dsDNA修復コンストラクトの濃度に比例します。したがって、修復テンプレートの濃度が高いほど、テンプレート化された修復がより効率的になります。しかし、350ng/μL以上のdsDNAを含む混合物の注入は、注入されたワームの生存率を低下させると示されている。したがって、最大で使用するのが最善ですが、その致死性を最小限に抑えながら修復効率を最大化するために、ミックス内のdsDNAの350 ng / μLを超える。
   1. 複数の crRNA を追加して、同時に複数の遺伝子座をターゲットにし、必要に応じて、共 CRISPR/共変換スクリーニングアプローチを行います。複数の crRNA を追加する場合は、マスター ミックスにそれぞれを順次追加します。
      注:各crRNAの量は同じである必要がなく、Cas9の濃度を変化させることなくマスターミックス中のcrRNAの総濃度を2倍にしても、特定の遺伝子座での突然変異の頻度を妨げているようには見えない。例はPaixらで詳細に説明されています。
   2. 5 sの場合は16,000 x gでRNP溶液をピペッティングして回転させ、チューブの底部で溶液を確実に回収します。
   3. 37°Cで15mの間に溶液をインキュベートする。
   4. サンプルを16,000 x gで1分間遠心分離し、薄い退屈なマイクロインジェクションニードルを詰まらせる可能性のある微粒子をペレットにします。上清は、以降のステップで使用します。
3. C.エレガンスの 準備

1. マイクロインジェクションの1日前:マイクロインジェクション用のアガロースパッドを準備します。

1. アガロースを水に加え、ホットプレートまたは電子レンジで沸騰させることで、水中に3%(w/v)アガロース溶液を作ります。
2. テーブルの上に24 mm x 50 mm x 1.5 mmのカバーガラススライドを配置し、ガラス製のパスツールピペットを使用して、小さな(約15 μL)のアガロース溶液をスライドに配置します。別のカバースリップを上に置くことによって、アガロースのドロップを素早く平らにします。アガロースを固め、カバーリップの1つを取り除きます。
3. アガロースコーティングされたカバースリップを一晩卓上に置いて乾燥させます。24時間後、アガロースパッドを清潔で乾燥した容器に保管します。
   注: これらは無期限に使用できます。

2.マイクロインジェクションニードルを引っ張る:フィラメント(外径1.0mmおよび内径0.58mm)を用いたホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して、メロとFire⁵⁷および他の資源に基づいて針を引っ張る。針はすぐに使用することができ、または粘土の支柱によって支えられて、きれいな、乾燥した容器に貯えることができる。

3.ワームのメンテナンスのために、ネマトデ成長培地(NGM)寒天をペトリプレートに注ぎ、OP50バクテリア(標準的なC.エレガンスのメンテナンスのプロトコルと成長培地のレシピについては、スティエナグルを参照)を準備してください。

マイクロインジェクションのためのワームをステージング:マイクロインジェクションの前に12-24時間、OP50細菌と新しいNG寒天板にL4段の雌雄同体を選び、20°Cで一晩インキュベート。 Cas9ターゲット/インジェクションミックスごとに、プレートに〜30個のワームを選びます。

4. マイクロインジェクションの日: ステップ1.2で準備したRNP溶液上清を使用して、プルドマイクロ注射針をロードします。
   1. ステップ1.2.4から上澄み液を引っ張ったキャピラリーピペットにピペットし、毛細管ピペットから調製されたマイクロインジェクションニードルに溶液をバックフィルします(一般的に0.1μL未満をロード)。
5. マイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロインジェクション装置に、装填された針を取り付けます。射出装置圧力を250kPa、バランス圧力を25kPaに設定します。
6. 装填された針先をブレークバックして、鋭利な針の端を生成します。24 mm x 50 mm x 1.5 mm のカバースリップの上に 15 mm x 15 mm x 1.5 mm の四角いカバースリップを置きます。
   1. 正方形のカバースリップの1つの端をハロカーボンオイル700で重ね合わせ。
   2. 針をオイルに、15 mmの正方形のカバースリップの端に置きます。
   3. 手で顕微鏡のステージとカバースリップをガイドし、注射ペダル/ボタンを押しながら針の端に沿ってスライドを磨きます。針先を後ろに破り、針から液体の流れを増やします。注射ミックスを針の端に沿って流し、~1気泡/sを形成することで、最適な流量を達成します。
7. マイクロインジェクションの前に12〜24時間摘んだL4ワームが注射の日に発達的に若年成人であることを確認する。OP50細菌を欠いているNG寒天プレートに若い成虫を選び、5分間這い回ることを可能にします。これにより、注射パッドに移される細菌の量が減少し、針の詰まりを最小限に抑えます。
8. アガロース注射パッド/カバースリップを解剖スコープに配置します。ワームピックを使用して、パッドの1つの端に沿ってハロカーボンオイルの小さなトラックを置きます。
9. 油でコーティングされたワームピックを使用して、NG寒天プレートから油のトラックにいくつかのワームを持ち上げます。まつげや猫のひげなどの細かい髪をピペットに取り付けた状態で、ワームを平行に配置し、ワームをアガロースパッドにそっと押し込みます。マイクロインジェクションの手順に慣れるまで、一度に1つのワームを取り付けて注入するだけです。
   注:乾燥アガロースは、ワームからの水分を吸引し、パッドに付着させます。その結果、ワームが乾燥する可能性がある場合、迅速に作業する必要があります。
   1. 一度位置に入れ、パッドに取り付け、ワームピックの先端からハロカーボンオイル(〜20μL)の別の数滴でワームをオーバーレイします。
10. C. エレガンスゴナドマイクロインジェクションと RMP およびポストインジェクション ケア
    マイクロインジェクションプロトコルは、メロとファイアから適応され、他の場所で詳細に説明されています。
    1. 取り付けられたワームを取り付けたカバースリップを注入顕微鏡に置きます。低倍率(5Xの目的、10Xの眼)の下で、注射針に垂直にワームを配置します。
       1. 高倍率(40X目的、10X眼)に切り替え、中~後期パチテンの核近くの領域に対応する生殖腺アームに隣接する針を再配置する。
       2. マイクロマニピュレーターを使用して、針をワームに対して動かし、キューティクルをわずかに落ち込まします。次に、片手で顕微鏡ステージの側面をタップして、キューティクルを通して針を揺らします。注射ペダル/ボタンを押し下げ、ゆっくりと注射ミックスで生殖腺アームを充填し、針を取り外します。
       3. 他の生殖腺アームでこの手順を繰り返します。
    2. ワームを注入したら、カバースリップ/アガロースパッドを取り外し、解剖顕微鏡の下に置きます。
       1. 引っ張られた毛細管ピペットを使用して、それらの上にM9バッファをピペット化することによってワームから油を置き換えます。寒天からワームを解放するためにこの治療を行います.
       2. 10分後、ワームが緩衝液の中でスラッシングしているとき、引っ張られた毛細管ピペットを使用してOP50細菌を持つNG寒天プレートに移動します。20°Cにプレートを2〜3時間置き、ワームが回復して動き回るまで置きます。
    3. 回収したら、OP50でNG寒天プレートにワームを個別に移し、プレートを25°Cインキュベーターに移します。
    4. P₀-注入されたワームが成長し、3日間子孫を置くことを許可します。F₁の子孫をスクリーニングします。
       1. 共CRISPRまたは共変換を使用する場合は、それらが参照遺伝子の突然変異表現型を有するかどうかに基づいてスクリーニングのための候補ワームを選択する。OP50を用いてこれらのマークされた虫を新しいNG寒天プレートに個別に移し、20°Cで_F2の子孫を置くことができます。
          注: 共CRISPRスクリーニングまたは選択に使用される表現型は、Cas9編集の成功の早期推定値を提供する必要があります。
       2. 共CRISPR表現型が存在しない場合、マイクロインジェクション効率の向上を補助する正の対照プラスミドをマイクロインジェクトする。
          注: 例えば、mCherryタグ付けされたMYO-2をコードする注入ミックス中のプラスミドを含む、注入効率を評価するのに役立つ。pCFJ90を正常に注入されたワームは、蛍光咽頭を持ついくつかの子孫を持つことになります。
    5. F₁ワームを調べて、必要な編集が行われたか確認します。F₁の母親を96ウェルプレートの個々のウェルに選び、彼女をlyseし、挿入特異的なPCR増幅、DNA配列分析、または測量器ヌクレアーゼアッセイ(CEL-1)のいずれかによってDNAを調べます。
       注: これらのアッセイは、共CRISPR/共変換またはその他のスクリーニングまたは選択レジームを使用する場合に実行することができる。

Representative Results

表1:ゲノム編集実験の予備のためのポジティブコントロールこの表は、このプロトコルで説明されている各細胞および生物において、初めてゲノム編集実験を行うために必要な重要な情報を示しています。これらのパラメータに従うと、実験者が自分の関心のある遺伝子を標的にした後、プロトコルをテストしたり、比較のベースラインとして使用できる成功した結果が得られる可能性があります。F:前方、R:逆、HDR:相同性指向の修復。 この表の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar