Gonad 미세 주입 : C. 예르건의 생식선으로 직접 화합물 전달 방법

Overview

이 비디오는 형질전환 C. elegans 균주를 만드는 일반적인 방법인 미세 주입을 설명합니다.   예에서, 우리는 CRISPR 염기 유전자 편집을 위한 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 소개하는 데 사용되는 미세 주입을 볼 것이다.

Protocol

다음 프로토콜은 다양한 세포및 유기체에서 Cas9 리보뉴클레오프로틴을 통한 향상된 게놈 편집, J. Vis. Exp. (2018)에서 발췌한 것입니다.

1. RNP 어셈블리

1. 모든 RNA, DNA 및 단백질 성분을 미리 획득하여 사전에 실험을 설계하십시오. 첫 번째 패스로 표 1에 나열된 양수 컨트롤 중 하나를 시도하고 재료 표에 설명된 상용 시약을 사용하여 신뢰할 수 있는 실험 설계와 재료의 무결성을 보장합니다. 새로운 게놈 편집 실험 계획에 대한 추가 팁은 이 주제에 대한 논문을 참조하십시오.
   참고: 후속 단계에 기재된 바와 같이 조립되면 사전에 제조된 RNP는 -80°C에 저장될 수 있다.
   1. 대상 유전자를 선택한 후 무료 온라인 도구 중 하나를 사용하여 최적의 gRNA를 설계하십시오. 녹아웃을 생성하려면 엑슨을 타겟팅하십시오.
      참고: 이러한 도구는 인접한 S. pyogenes PAM 서열, 고품질 점수 및 낮은 오프 타겟 점수로 대상 부위를 식별하는 데 도움이 됩니다.
   2. 출판 된 방법을 통해 S. pyogenes Cas9 단백질을 정화하거나 상업 공급 업체에서 구입.
   3. 20mM의 HEPES pH 7.5, 150mMMKCl, 10% 글리세롤 및 TCEP 1mMM을 포함하는 RNA 희석, RNP 제제 및 단백질 저장을 위한 전형적인 Cas9 버퍼를 준비한다. 항상 열화를 방지하기 위해 RNA를 재일시 중단하거나 희석하는 데 사용되는 버퍼에 핵이없는 물을 사용합니다.
   4. 가이드 RNA를 생산 (tracrRNA 및 crRNA 또는 sgRNA) 출판 된 방법을 사용하여 체외 전사를 통해, 또는 핵 산 합성 회사에서 구입.
   5. 유전자를 삽입하는 경우 기증자 DNA 템플릿을 합성하거나 구입하십시오.
   6. 단백질과 RNA 알리쿼트를 -80°C에 저장하고 사용하기 직전에 얼음위에 해동하십시오.
      참고: 각 동결 해동은 효율성을 약간 낮춥춥습니다. Cas9 정화 및 sgRNA의 시험관 내 전사에 대한 자세한 오픈 액세스 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수 있습니다.
2. C. elegans 편집을 위한 RNP 준비: 20 μL의 최종 부피를 만들기 위해 다음 시약을 추가하여 RNP 복합체를 조립합니다(최종 농도는 괄호안에 기록됨): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7.5 (10 μM), KCl(115 μM), crRNA(12μM), tracrRNA(40 μM), 및 필요한 경우 수리 템플릿(0.5 μM ssDNA 또는 최대 350ng/μL dsDNA).
   참고: Cas9 매개 DSB 템플릿 수리의 효율은 dsDNA 수리 구조의 농도에 비례한다; 따라서, 수리 템플릿의 농도가 높을수록 템플릿 수리가 효율적입니다. 그러나, dsDNA의 350 ng/μL 보다 큰 혼합을 포함하는 혼합의 주입은 주입된 벌레의 생존가능성을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, 최대 350ng/μL 이하의 dsDNA를 혼합하여 사용하는 것이 가장 좋습니다.
   1. 공동 CRISPR/공동 변환 스크리닝 접근 방식에 필요한 대로 여러 개의 crRNA를 추가하여 동시에 여러 loci를 타겟팅합니다. 두 개 이상의 crRNA를 추가할 때 마스터 믹스에 각각을 순차적으로 추가합니다.
      참고: 각 crRNA의 양은 동일할 필요가 없으며, Cas9의 농도를 변경하지 않고 마스터 믹스에서 crRNAs의 총 농도를 두 배로 늘리더라도 특정 궤적에서 돌연변이 발생의 빈도를 방해하지 않는 것으로 나타나지 않는다. 예는 Paix 외에서 자세히 설명됩니다.
   2. 파이프팅으로 섞어서 RNP 용액을 16,000 x g에서 5s로 회전하여 용액이 튜브 의 하단에 수집되도록 합니다.
   3. 15m용 37°C에서 용액을 배양한다.
   4. 16,000 x g의 샘플을 1분 동안 원심분리하여 얇은 지루한 미세 분사 바늘을 막을 수 있는 미립자를 펠릿합니다. 후속 단계에서 상체를 사용합니다.
3. C. 예인대 준비

1. 미세 주입 1 일 전에 : 미세 주입을위한 아가로즈 패드를 준비합니다.

1. 물에 아가로즈를 추가하고 뜨거운 접시 또는 전자 레인지에 끓여용액을 가져와 물에 3 % (w / v) 아가로즈 용액을 만듭니다.
2. 테이블에 24mm x 50mm x 1.5mm 커버 글래스 슬라이드를 정렬하고 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 작은 (~15 μL) 낙하용을 슬라이드에 놓습니다. 다른 커버슬립을 위에 두어 아가로즈 드롭을 빠르게 평평하게 합니다. 아가로즈가 고체화한 다음 커버립 중 하나를 제거하도록 허용합니다.
3. 아가로즈 코팅 커버슬립을 하룻밤 동안 탁상에 올려 두고 건조시다. 24시간 후, 아가로즈 패드를 깨끗하고 건조한 용기에 보관하십시오.
   참고: 이 것들은 무기한으로 사용될 수 있습니다.

2. 미세 주입 바늘을 당기기 : 필라멘트 (외부 직경 1.0mm 및 내지0.58mm)와 보로 실리케이트 유리 모세 혈관을 사용하여 멜로와 화재⁵⁷ 및 기타 자원을 기반으로 바늘을 당깁니다. 바늘은 즉시 사용할 수 있거나 점토 지지대로 인해 깨끗하고 건조한 용기에 보관할 수 있습니다.

3. 벌레의 유지 보수를 위해, 페트리 플레이트에 부어 OP50 박테리아 (표준 C. elegans 유지 보수 및 성장 매체에 대한 조리법에 대한 프로토콜에 대한, Stiernagle참조)로 발견 된 선충 성장 미디어 (NGM) 한천을 준비하십시오.

4. 미세 주입을위한 웜을 단계 : 미세 주입 전에 12-24 시간, OP50 박테리아와 새로운 NG-agar 접시에 L4 단계 헤르마로다이트를 선택하고 20 ° C에서 하룻밤 을 배양. 각 Cas9 대상/사출 믹스에 대해 ~ 30개의 웜을 플레이트에 선택합니다.

4. 미세 주입의 날: 1.2 단계에서 제조된 RNP 용액 슈퍼나탈로 뽑아낸 미세 주입 바늘을 적재합니다.
   1. 1.2.4 단계에서 상체피로 당겨진 모세관 파이펫으로 들어가 서용액을 모세관 파이펫에서 제조된 미세 주입 바늘로 백필한다(일반적으로 0.1 μL 미만).
5. 마이크로 조작기에 부착 된 미세 주입 장치에로드 된 바늘을 장착합니다. 사출 장치 압력을 250 kPa로 설정하고 밸런스 압력을 25 kPa로 설정합니다.
6. 로드된 바늘 끝을 뒤로 분해하여 날카로운 바늘 가장자리를 생성합니다. 15mm x 15mm x 1.5mm 스퀘어 커버슬립을 24mm x 50mm x 1.5mm 커버슬립 위에 놓습니다.
   1. 할로카본 오일 700으로 사각형 커버슬립의 한쪽 가장자리를 오버레이합니다.
   2. 15mm 정사각형 커버슬립의 가장자리에 바늘을 오일에 배치합니다.
   3. 현미경 단계와 커버 슬립을 안내하는 손을 사용하여 주입 페달 / 버튼을 우울하게하면서 바늘 가장자리를 따라 슬라이드를 위아래로 브러시합니다. 바늘 끝을 뒤로 부수고 바늘에서 액체의 흐름을 증가시다. 주사 혼합이 바늘의 가장자리를 따라 위로 흐르게하여 ~ 1 버블 /s를 형성하여 최적의 유량을 달성하십시오.
7. L4 벌레는 마이크로 주입 전에 12-24 h를 골랐다는 것을 확인은 주입의 날에 발달한 젊은 성인입니다. OP50 박테리아가 부족한 NG-agar 접시에 젊은 성인 벌레를 선택하고 5 분 동안 기어 다니수 있습니다. 이것은 주사 패드로 옮겨진 박테리아의 양을 감소시키고, 바늘 나막신을 최소화합니다.
8. 해부 범위에 아가로즈 사출 패드/커버슬립을 놓습니다. 웜 픽을 사용하여 패드의 한쪽 가장자리를 따라 할로카본 오일의 작은 트랙을 놓습니다.
9. 오일로 코팅된 벌레 픽을 사용하여 NG-agar 플레이트에서 여러 벌레를 들어 올려 기름 트랙으로 들어올립니다. 속눈썹이나 고양이 수염과 같은 파이펫에 미세한 머리카락이 부착되어 웜을 병렬로 배치하여 벌레를 아가로즈 패드로 부드럽게 밀어 넣습니다. 미세 주입 절차에 익숙할 때까지 한 번에 하나의 웜만 마운트하고 주입합니다.
   참고: 마른 아가로즈는 벌레의 수분을 심어 패드에 부착합니다. 따라서 웜이 소멸될 수 있으므로 신속하게 작동해야 합니다.
   1. 위치에 있고 패드에 부착되면 웜을 웜 픽 끝에서 할로카본 오일 (~20 μL)의 몇 방울로 오버레이하십시오.
10. C. rnP 및 사후 주입 관리를 가진 고나드 미세 주입
    미세 주입 프로토콜은 멜로와 화재에서 적응하고 다른 곳에서 자세히 설명합니다.
    1. 장착된 웜을 주입 현미경에 놓습니다. 낮은 배율(5배 목표, 10X 안구)에서 벌레를 주사 바늘에 수직으로 배치한다.
       1. 높은 배율(40X 목표, 10X 안구)로 전환하여, 중후반 파시텐에서 핵 근처의 부위에 대응하는 고나드 암에 인접한 바늘을 재배치한다.
       2. 미세 조작기를 사용하여 바늘을 벌레에 대고 약간 큐티클을 우울하게 합니다. 그런 다음, 한 손으로, 큐티클을 통해 바늘을 충격 현미경 단계의 측면을 누릅니다. 사출 페달 /버튼을 누르고 천천히 주입 믹스와 gonad 팔을 채우고 바늘을 제거합니다.
       3. 다른 고나드 팔로 이 단계를 반복합니다.
    2. 벌레가 주입되면 커버 슬립 / 아가로즈 패드를 제거하고 해부 현미경 아래에 놓습니다.
       1. 끌어온 모세관 파이펫을 사용하여 M9 버퍼를 파이프로 피펫하여 웜에서 오일을 변위시합니다. 이 치료를 수행하여 한천에서 웜을 방출합니다.
       2. 10 분 후, 벌레가 완충제에서 주위를 분쇄 할 때, 뽑아 모세관 파이펫을 사용하여 OP50 박테리아와 NG-agar 접시로 이동합니다. 웜이 회복되고 움직일 때까지 플레이트를 2-3h의 20°C로 놓습니다.
    3. 일단 회수되면, 개별적으로 OP50NG-agar 플레이트에 웜을 전송하고 25 °C 인큐베이터로 플레이트를 전송합니다.
    4. P0-주입된 벌레가 3일 동안 자손을 키우고 자손있게 할 수 있도록 합니다. F₁ 자손을 화면으로 보입니다.
       1. 공동 CRISPR 또는 공동 변환을 사용하는 경우, 참조 유전자의 돌연변이 표현형이 있는지 여부에 따라 스크리닝을 위한 후보 웜을 선택합니다. 이러한 표시된 웜을 OP50이있는 새로운 NG-agar 플레이트로 개별적으로 전송하고 20 °C에서 F₂ 자손을 배치 할 수 있습니다.
          참고: 공동 CRISPR 스크리닝 또는 선택에 사용되는 표현형은 Cas9 편집의 성공에 대한 조기 추정치를 제공해야 합니다.
       2. 공동 CRISPR 표현형이 존재하지 않는 경우, 미세 주입 효율 을 개선하는 데 도움이 양성 제어 플라스미드를 마이크로 젝션.
          참고: 예를 들어, mCherry 태그 MYO-2를 인코딩하는 사출 믹스에 플라스미드를 포함하면 사출 효율을 평가하는 데 도움이 됩니다. pCFJ90을 성공적으로 주입한 벌레는 형광 인두를 가진 일부 자손을 갖게 될 것입니다.
    5. 원하는 편집이 있으면 F₁ 웜을 검사합니다. F₁ 어머니를 96웰 플레이트의 개별 우물에 선택하고, 그녀를 lyse하고, 삽입 특정 PCR 증폭, DNA 서열 분석 또는 측량제 뉴클레아제 분석(CEL-1)을 삽입하여 그녀의 DNA를 검사한다.
       참고: 이러한 소는 공동 CRISPR/공동 변환 또는 기타 선별 또는 선택 체제를 사용할 때 수행할 수 있습니다.

Representative Results

표 1: 예비 게놈 편집 실험에 대한 긍정적인 제어. 이 표는 이 프로토콜에 기술된 각 세포 및 유기체에서 처음 게놈 편집 실험을 수행하는 데 필요한 주요 정보를 보여줍니다. 이러한 매개 변수에 따라 실험자가 자신의 관심 유전자를 대상으로 한 후 프로토콜을 테스트하거나 비교를 위한 기준선으로 사용될 수 있는 성공적인 결과를 얻을 가능성이 높습니다. F : 앞으로, R : 역, HDR : 동성애 지향 수리. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar