Microinjeção gonad: um método de entrega composta diretamente na germinal de C. elegans

Overview

Este vídeo descreve a microinjeção, um método comum de criação de cepas transgênicas de C. elegans.   No exemplo, veremos a microinjeção usada para introduzir um complexo de ribonucleoproteína (RNP) para edição de genes crispr-bases.

Protocol

O protocolo a seguir é um trecho de Farboud et al, Edição aprimorada de genoma com Cas9 Ribonucleoproteína em Diversas Células e Organismos, J. Vis. Exp. (2018).

1. Montagem RNP

1. Projete o experimento com bastante antecedência, adquirindo todos os componentes de RNA, DNA e proteínas antes do tempo. Como primeira passagem, experimente um dos controles positivos listados na Tabela 1 e use os reagentes comerciais descritos na Tabela de Materiais para garantir um design experimental confiável e a integridade dos materiais. Para obter dicas adicionais sobre como planejar um novo experimento de edição de genomas, consulte artigos sobre este tópico.
   NOTA: Uma vez montadas como descrito nas etapas subsequentes, as RNPs preparadas com antecedência podem ser armazenadas a -80 °C.
   1. Depois de escolher qual gene atingir, use uma das ferramentas online gratuitas para projetar um gRNA ideal. Certifique-se de atingir um exon se espera gerar um nocaute.
      NOTA: Essas ferramentas ajudarão a identificar um local de destino com uma sequência ADJACENTE S. pyogenes PAM, pontuação de alta qualidade e pontuação baixa fora do alvo.
   2. Purificar a proteína S. pyogenes Cas9 através de métodos publicados ou comprá-la de um fornecedor comercial.
   3. Prepare um tampão Cas9 típico para a diluição de RNA, preparação RNP e armazenamento de proteínas, que contém 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de KCl, 10% glicerol e 1 mM de TCEP. Use sempre água sem nuclease em buffers que serão usados para resuspend ou diluir o RNA para evitar a degradação.
   4. Produza o guia RNA (tracrRNA e crRNA ou sgRNA) através de uma transcrição in vitro usando métodos publicados, ou compre-o de uma empresa de síntese de ácido nucleico.
   5. Se inserir um gene, sintetize ou compre um modelo de DNA de doador.
   6. Armazene as alíquotas de proteína e RNA a -80 °C e descongele no gelo imediatamente antes de usar.
      NOTA: Cada congelamento diminui ligeiramente a eficiência. Protocolos detalhados de acesso aberto para purificação cas9 e a transcrição in vitro de sgRNAs estão disponíveis em outros lugares.
2. Preparação RNP para C. edição de elegans: Montar o complexo RNP adicionando os seguintes reagentes a fim de criar um volume final de 20 μL (as concentrações finais são notadas entre parênteses): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7.5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) e os modelos de reparo, se necessário (0,5 μM ssDNA ou até 350 ng/μL dsDNA).
   NOTA: A eficiência de um reparo com modelagem DSB mediada pelo Cas9 é proporcional à concentração do construto de reparo dsDNA; assim, quanto maior a concentração do modelo de reparo, mais eficiente é o reparo modelado. No entanto, uma injeção de misturas contendo mais de 350 ng/μL de dsDNA tem sido demonstrada para reduzir a viabilidade dos vermes injetados. Assim, é melhor usar até, mas não mais do que 350 ng/μL de dsDNA na mistura para maximizar a eficiência do reparo, minimizando sua letalidade.
   1. Adicione vários crRNAs para atingir vários loci simultaneamente, conforme necessário para a abordagem de triagem co-CRISPR/co-conversão. Ao adicionar mais de um crRNA, adicione cada um sequencialmente à mistura mestre.
      NOTA: A quantidade de cada crRNA não precisa ser a mesma, e mesmo dobrar a concentração total de crRNAs na mistura mestre sem alterar a concentração de Cas9 não parece interferir com a frequência de mutagênese em um lócus específico. Exemplos são descritos em detalhes em Paix et al.
   2. Misture por pipetação e gire a solução RNP a 16.000 x g por 5 s para garantir que a solução seja coletada na parte inferior do tubo.
   3. Incubar a solução a 37 °C por 15 m.
   4. Centrifugar a amostra a 16.000 x g por 1 min para doar quaisquer partículas que pudessem entupir a agulha de microinjeção fina e entediada. Use o supernatante nas etapas subsequentes.
3. Preparação de C. elegans

1. 1 dia antes da microinjeção: Prepare as almofadas de agarose para a microinjeção.

1. Faça uma solução de 3% (w/v) em água adicionando agarose à água e trazendo a solução para ferver em uma placa quente ou em um micro-ondas.
2. Disponha lâminas de vidro de cobertura de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm sobre uma mesa e use uma pipeta Pasteur de vidro para colocar uma pequena (~15 μL) gota de solução de agarose no slide. Achate rapidamente a queda de agarose colocando outra mancha de cobertura em cima. Deixe a agarose solidificar e, em seguida, remova uma das tampas.
3. Deixe a tampa revestida de agarose face-up em uma mesa durante a noite para secar. Depois de 24 horas, armazene as almofadas de agarose em um recipiente limpo e seco.
   NOTA: Estes podem ser usados indefinidamente.

2. Puxe as agulhas de microinjeção: utilizando capilares de vidro borossilicato com filamentos (diâmetro externo 1,0 mm e diâmetro interno 0,58 mm), puxe as agulhas à base de Mello e Fire⁵⁷ e outros recursos. As agulhas podem ser usadas imediatamente ou podem ser armazenadas em um recipiente limpo e seco, preparado por suportes de argila.

3. Para a manutenção dos vermes, prepare um ágar Nematode Growth Media (NGM) derramado em placas de Petri e manchado com bactérias OP50 (para protocolos de manutenção padrão C. elegans e receitas para mídia de crescimento, consulte Stiernagle).

4. Estágio dos vermes para microinjeção: 12-24 h antes da microinjeção, escolha hermafroditas l4 encenadas para uma nova placa NG-ágar com bactérias OP50 e incuba-los durante a noite a 20 °C. Para cada mistura de alvo/injeção Cas9, escolha ~30 vermes na placa.

4. Dia da microinjeção: Carregue a agulha de microinjeção puxada com a supernascer de solução RNP preparada na etapa 1.2.
   1. Pipeta o supernascer da etapa 1.2.4 em uma pipeta capilar puxada e enchir a solução da pipeta capilar para a agulha de microinjeção preparada (geralmente carregando menos de 0,1 μL).
5. Monte a agulha carregada no aparelho de microinjeção ligado a um micromanipulador. Coloque a pressão do aparelho de injeção em 250 kPa e a pressão de equilíbrio para 25 kPa.
6. Quebre a ponta da agulha carregada para gerar uma borda afiada da agulha. Coloque uma cobertura quadrada de 15 mm x 15 mm x 1,5 mm na parte superior de uma tampa de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
   1. Sobrepor uma borda da tampa quadrada com óleo de halocarboneto 700.
   2. Posicione a agulha no óleo, na borda da tampa quadrada de 15 mm.
   3. Usando uma mão para guiar o estágio do microscópio e a mancha de cobertura, escove o slide para cima e ao longo da borda da agulha enquanto deprimi o pedal/botão de injeção. Quebre a ponta da agulha para trás, aumentando o fluxo do líquido para fora da agulha. Obtenha uma taxa de fluxo ideal fazendo com que a mistura de injeção flua ao longo da borda da agulha, formando ~1 bolha/s.
7. Confirme que os vermes L4 colhidos 12-24 h antes da microinjeção são jovens adultos em desenvolvimento no dia da injeção. Escolha os vermes adultos jovens em uma placa de NG-ágar que não tem bactérias OP50 e permita que eles rastejem por 5 minutos. Isso reduz a quantidade de bactérias transferidas para a almofada de injeção, minimizando os tamancos da agulha.
8. Coloque uma almofada de injeção de agarose/tapa-tampa em um escopo de dissecção. Usando uma picareta de vermes, coloque uma pequena faixa de óleo de halocarboneto ao longo de uma borda da almofada.
9. Usando a picareta de verme revestida em óleo, levante vários vermes da placa NG-ágar e na trilha do óleo. Com um cabelo fino preso a uma pipeta, como um cílio ou bigode de gato, posicione os vermes em paralelo, empurrando suavemente os vermes para dentro da almofada de agarose. Até ficar confortável com o procedimento de microinjeção, basta montar e injetar um verme de cada vez.
   NOTA: A agarose seca vai paviar a umidade dos vermes, fazendo com que eles aderam à almofada. Consequentemente, deve-se trabalhar rapidamente, pois os vermes podem se dessinsicar.
   1. Uma vez em posição e conectado à almofada, sobreponha os vermes com outras gotas de óleo de halocarbono (~20 μL) da ponta da picareta do worm.
10. C. elegans Gnad Microinjeção com RNPs e Cuidados Pós-injeção
    O protocolo de microinjeção é adaptado de Mello e Fire e descrito em detalhes em outros lugares.
    1. Coloque a mancha de cobertura com os vermes montados no microscópio de injeção. Sob uma baixa ampliação (objetivo 5X, 10X ocular), posicione os vermes perpendiculares à agulha de injeção.
       1. Mude para uma alta ampliação (objetivo 40X, 10X ocular), reposicione a agulha adjacente ao braço de gônada correspondente à região próxima aos núcleos no meio do paquiteno médio-tardio.
       2. Usando o micromanipulador, mova a agulha contra o verme, deprimindo ligeiramente a cutícula. Em seguida, com uma mão, toque na lateral do estágio do microscópio para sacudir a agulha através da cutícula. Pressione o pedal/botão de injeção e encha lentamente o braço da gônada com a mistura de injeção e remova a agulha.
       3. Repita este passo com o outro braço de gônada.
    2. Uma vez que os vermes sejam injetados, remova a almofada de deslizamento/agarose e coloque-a sob um microscópio dissecando.
       1. Usando uma pipeta capilar puxada, desloque o óleo dos vermes, pipetando um tampão M9 sobre eles. Realize este tratamento para liberar os vermes do ágar.
       2. Depois de 10 minutos, quando os vermes estiverem batendo no buffer, mova-os para uma placa NG-ágar com bactérias OP50 usando a pipeta capilar puxada. Coloque a placa a 20 °C por 2-3 h até que os vermes se recuperem e estejam se movendo.
    3. Uma vez recuperado, transfira individualmente os vermes para placas de NG-ágar com OP50 e transfira as placas para uma incubadora de 25 °C.
    4. Permita que osvermes injetados P₀cresçam e coloquem progênere por 3 dias. Tela a prole F_1.
       1. Se usar co-CRISPR ou co-conversão, selecione os worms candidatos para triagem com base em se eles têm o fenótipo mutante do gene de referência. Transfira individualmente esses vermes marcados para novas placas de NG-ágar com OP50 e permita que eles coloquem a prole F₂ a 20 °C.
          NOTA: O fenótipo usado para uma triagem ou seleção co-CRISPR deve fornecer uma estimativa inicial para o sucesso da edição cas9.
       2. Se o fenótipo co-CRISPR não estiver presente, microinjete um plasmídeo de controle positivo para auxiliar na melhoria da eficiência da microinjeção.
          NOTA: Por exemplo, incluir um plasmídeo na mistura de injeção que codifica myo-2 com marca mCherry ajudará a avaliar a eficiência da injeção. Vermes injetados com sucesso com pCFJ90 terão alguns descendentes com faringes fluorescentes.
    5. Examine os worms F₁ para a presença das edições desejadas. Escolha a mãe F₁ para um poço individual de uma placa de 96 poços, lise-a, e examine seu DNA por amplificação pcr específica de inserção, análise de sequência de DNA ou ensaio de nuclease do agrimensor (CEL-1).
       NOTA: Esses ensaios podem ser realizados ao usar um co-CRISPR/co-conversão ou outros regimes de triagem ou seleção.

Representative Results

Tabela 1: Controles positivos para experimentos preliminares de edição de genomas. Esta tabela mostra as principais informações necessárias para realizar um experimento de edição de genoma pela primeira vez em cada uma das células e organismos descritos neste protocolo. Seguir esses parâmetros é provável que produza um resultado bem-sucedido que pode ser usado para testar o protocolo ou como uma linha de base para comparação uma vez que o experimentador está mirando um gene de seu próprio interesse. F: para a frente, R: reverso, HDR: reparo direcionado à escarologia. Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar