Gonad Microinjection: C. elegans'ın Germline'ına Doğrudan Bileşik Teslimat Yöntemi

Overview

Bu videoda transgenik C. elegans suşları oluşturmanın yaygın bir yöntemi olan mikroenjeksiyon açıklanmaktadır.  Örnekte, CRISPR tabanlı gen düzenleme için ribonikleoprotein (RNP) kompleksini tanıtmak için kullanılan mikroenjeksiyonları göreceğiz.

Protocol

Aşağıdaki protokol Farboud ve ark, Çeşitli Hücre ve Organizmalarda Cas9 Ribonucleoprotein ile Geliştirilmiş Genom Düzenleme, J. Vis. Exp. (2018) bir alıntıdır.

1. RNP Montajı

1. Tüm RNA, DNA ve protein bileşenlerini önceden elde ederek deneyi önceden tasarlayın. İlk geçiş olarak, Tablo 1'de listelenen pozitif kontrollerden birini deneyin ve güvenilir bir deneysel tasarım ve malzemelerin bütünlüğünü sağlamak için Malzeme Tablosunda açıklanan ticari reaktifleri kullanın. Yeni bir genom düzenleme deneyi planlama hakkında ek ipuçları için bu konudaki makalelere bakın.
   NOT: Sonraki adımlarda açıklandığı gibi monte edildikten sonra, önceden hazırlanan RNP'ler -80 °C'de saklanabilir.
   1. Hangi genin hedeflenmeyi seçeceklerini seçtikten sonra, en uygun gRNA'yı tasarlamak için ücretsiz çevrimiçi araçlardan birini kullanın. Nakavt yaratmayı umuyorsanız, bir dış kapıyı hedeflediğinden emin olun.
      NOT: Bu araçlar, bitişik bir S. pyogenes PAM dizisi, yüksek kaliteli puan ve düşük hedef dışı puana sahip bir hedef siteyi tanımlamaya yardımcı olacaktır.
   2. S. pyogenes Cas9 proteinini yayınlanan yöntemlerle saflaştırın veya ticari bir satıcıdan satın alın.
   3. 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, %10 gliserol ve 1 mM TCEP içeren RNA seyreltme, RNP hazırlama ve protein depolama için tipik bir Cas9 tamponu hazırlayın. Bozulmayı önlemek için RNA'yı yeniden kullanmak veya seyreltmek için kullanılacak tamponlarda her zaman çekirdeksiz su kullanın.
   4. Yayınlanan yöntemleri kullanarak bir in vitro transkripsiyon yoluyla kılavuz RNA 'yı (tracrRNA ve crRNA veya sgRNA) üretin veya bir nükleik asit sentez şirketinden satın alın.
   5. Bir gen eklerseniz, bir donör DNA şablonu sentezleyin veya satın alın.
   6. Protein ve RNA aliquotlarını -80 °C'de saklayın ve kullanmadan hemen önce buzda çözün.
      NOT: Her donma-çözülme verimliliği biraz düşürür. Cas9 saflaştırma ve sgRNA'ların in vitro transkripsiyonu için ayrıntılı, açık erişim protokolleri başka bir yerde mevcuttur.
2. C için RNP hazırlığı elegans düzenleme: 20 μL'lik son bir hacim oluşturmak için aşağıdaki reaktifleri ekleyerek RNP kompleksini birleştirin (son konsantrasyonlar parantez içinde not edilir): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7.5 (10 μM), KCL (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) ve gerekirse onarım şablonları (0,5 μM ssDNA veya 350 ng/μL dsDNA'ya kadar).
   NOT: Cas9 aracılı DSB şablonlu onarımın verimliliği, dsDNA onarım yapısı konsantrasyonu ile orantılıdır; böylece, onarım şablonunun konsantrasyonu ne kadar yüksek olursa, şablonlu onarım o kadar verimli olur. Bununla birlikte, enjekte edilen solucanların canlılığını azaltmak için 350 ng / μL'den fazla dsDNA içeren bir karışım enjeksiyonu gösterilmiştir. Bu nedenle, ölümcüllüğünü en aza indirirken onarım verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için karışımda en fazla 350 ng / μL dsDNA kullanmak en iyisidir.
   1. Co-CRISPR/co-conversion tarama yaklaşımı için gerektiğinde, aynı anda birden fazla loci hedeflemek için birden fazla crRNA ekleyin. Birden fazla crRNA eklerken, her birini ana karışıma sırayla ekleyin.
      NOT: Her crRNA miktarının aynı olması gerekmez ve cas9 konsantrasyonunu değiştirmeden ana karışımdaki toplam crRNA konsantrasyonunu iki katına çıkarmak bile belirli bir lokustaki mutajensis frekansını engellemiyor gibi görünmektedir. Örnekler Paix ve ark.'da ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
   2. Pipetleme ile karıştırın ve çözeltinin tüpün altında toplandığından emin olmak için RNP çözeltisini 5 s için 16.000 x g'da döndürün.
   3. Çözeltiyi 15 m boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
   4. İnce sıkılmış mikroenjeksiyon iğnesini tıkayabilecek partikülleri peletmek için numuneyi 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüj edin. Sonraki adımlarda süpernatant kullanın.
3. C. elegans Hazırlık

1. Mikroenjeksiyondan 1 gün önce: Agarose pedlerini mikroenjeksiyon için hazırlayın.

1. Suya agarose ekleyerek ve çözeltiyi sıcak bir tabakta veya mikrodalgada kaynatarak suda% 3 (w/ v) agarose çözeltisi yapın.
2. Bir masaya 24 mm x 50 mm x 1,5 mm kapak cam slaytları yerleştirin ve küçük (~15 μL) bir agarose çözeltisi damlasını slayda yerleştirmek için cam pastör pipet kullanın. Üzerine başka bir kapak kılıfı yerleştirerek agarose damlasını hızla düzleştirin. Agarose'un katılaşmasına izin verin ve ardından kapaklardan birini çıkarın.
3. Agarose kaplı coverlip'i kuruması için bir gece boyunca bir masanın üzerine yüzüstü bırakın. 24 saat sonra, agarose pedlerini temiz ve kuru bir kapta saklayın.
   NOT: Bunlar süresiz olarak kullanılabilir.

2. Mikroenjeksiyon iğnelerini çekin: filamentli borosilikat cam kılcal damarları (dış çapı 1.0 mm ve iç çapı 0.58 mm) kullanarak, Mello ve Fire⁵⁷ ve diğer kaynaklara dayalı iğneleri çekin. İğneler hemen kullanılabilir veya kil destekleri ile desteklenmiş temiz, kuru bir kapta saklanabilir.

3. Solucanların bakımı için, Petri plakalarına dökülen ve OP50 bakterisi ile tespit edilen bir Nematod Growth Media (NGM) agar hazırlayın (standart C. elegans bakımı protokolleri ve büyüme ortamı tarifleri için, bkz. Stiernagle).

4. Solucanları mikroenjeksiyon için sahnele: Mikroenjeksiyondan 12-24 saat önce, L4 aşamalı hermafroditleri OP50 bakterisi içeren yeni bir NG-agar plakasına toplayın ve 20 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Her Cas9 hedef/enjeksiyon karışımı için plakaya ~30 solucan seçin.

4. Mikroenjeksiyon günü: Çekilen mikroenjeksiyon iğnesini adım 1.2'de hazırlanan RNP çözeltisi süpernatantı ile yükleyin.
   1. Pipet süpernatant adım 1.2.4'ten çekilmiş bir kılcal pipete ve çözeltiyi kılcal pipetten hazırlanan mikroenjeksiyon iğnesine geri doldurun (genellikle 0.1 μL'den az yükleme).
5. Yüklü iğneyi bir mikromanipülatöre bağlı mikroenjeksiyon cihazına monte edin. Enjeksiyon cihazı basıncını 250 kPa'ya ve denge basıncını 25 kPa'ya ayarlayın.
6. Keskin bir iğne kenarı oluşturmak için yüklü iğne ucunu geri kırın. 24 mm x 50 mm x 1,5 mm örtünün üstüne 15 mm x 15 mm x 1,5 mm kare kapak kılıfı yerleştirin.
   1. Kare örtünün bir kenarını halokarbon yağı 700 ile kaplayın.
   2. İğneyi yağda, 15 mm kare kapak ucunun kenarına yerleştirin.
   3. Mikroskop aşamasını ve kapak tonunu yönlendirmek için bir el kullanarak, enjeksiyon pedalını / düğmesini bastırırken kaydırağı yukarı ve iğnenin kenarı boyunca fırçalayın. İğne ucunu geri kırarak sıvının iğneden akışını artırın. Enjeksiyon karışımını iğnenin kenarı boyunca akarak ~1 kabarcık/s oluşturarak optimum bir akış hızı elde edin.
7. Mikroenjeksiyondan önce 12-24 saat toplanan L4 solucanlarının enjeksiyon gününde gelişimsel olarak düzenlenmiş genç yetişkinler olduğunu onaylayın. Genç yetişkin solucanları OP50 bakterisi olmayan bir NG-agar plakasına alın ve 5 dakika boyunca sürünmelerine izin verin. Bu, enjeksiyon yastığına aktarılan bakteri miktarını azaltarak iğne tıkanıklıklarını en aza indirir.
8. Diseksiyon kapsamına bir agarose enjeksiyon pedi / kapak kılıfı yerleştirin. Bir solucan toplama kullanarak, pedi bir kenarı boyunca küçük bir halokarbon yağı izi döşeyin.
9. Yağla kaplanmış solucan çekmesini kullanarak, NG-agar plakasından ve yağ izine birkaç solucan kaldırın. Kirpik veya kedi bıyık gibi bir pipete bağlı ince bir saçla, solucanları paralel olarak konumlandırın, solucanları hafifçe agarose pedine itin. Mikroenjeksiyon prosedürü ile rahat olana kadar, aynı anda sadece bir solucan takın ve enjekte edin.
   NOT: Kuru agarose, solucanlardan gelen nemi fitilleyecek ve pedlere yapışmalarına neden olacaktır. Sonuç olarak, solucanlar çözünebildiği için hızlı bir şekilde çalışmak gerekir.
   1. Bir kez konuma geldikten ve pedlere bağlandıktan sonra, solucanları solucan toplamanın ucundan birkaç damla halokarbon yağı (~20 μL) ile kaplayın.
10. C. elegans Gonad Microinjection ile RNPs ve Enjeksiyon Sonrası Bakım
    Mikroenjeksiyon protokolü Mello ve Fire'dan uyarlanmıştır ve başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
    1. Kapak kapağını monte edilmiş solucanlarla enjeksiyon mikroskobuna yerleştirin. Düşük büyütme altında (5X amaç, 10X oküler), solucanları enjeksiyon iğnesine dik olarak konumlandırın.
       1. Yüksek büyütmeye geçin (40X amaç, 10X oküler), iğneyi orta ila geç pachytene'de çekirdeğin yakınındaki bölgeye karşılık gelen gonad koluna bitişik olarak yeniden konumlandırın.
       2. Mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi solucana doğru hareket ettirin, kütikülü hafifçe bastırın. Ardından, bir elinizle, iğneyi lütikülden geçirmek için mikroskop aşamasının yanına dokunun. Enjeksiyon pedalını /düğmesini bastırın ve gonad kolunu enjeksiyon karışımı ile yavaşça doldurun ve iğneyi çıkarın.
       3. Bu adımı diğer gonad koluyla tekrarlayın.
    2. Solucanlar enjekte edildikten sonra, kapak kılıfı / agarose pedi çıkarın ve bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
       1. Çekilmiş bir kılcal pipet kullanarak, üzerlerine bir M9 tamponu pipetleme ile yağı solucanlardan yerinden edin. Solucanları agardan serbest bırakmak için bu tedaviyi gerçekleştirin.
       2. 10 dakika sonra, solucanlar tamponda çırpınırken, çekilen kılcal pipet kullanarak OP50 bakterisi içeren bir NG-agar plakasına taşıyın. Solucanlar iyileşene ve hareket edene kadar plakayı 2-3 saat boyunca 20 °C'ye yerleştirin.
    3. Kurtarıldıktan sonra, solucanları OP50 ile NG-agar plakalarına ayrı ayrı aktarın ve plakaları 25 °C inkübatöre aktarın.
    4. P₀enjekte edilen solucanların 3 gün boyunca üremesine ve üremesine izin verin. F₁ yavrularını tarayın.
       1. Co-CRISPR veya birlikte dönüştürme kullanıyorsanız, referans geninin mutant fenotipine sahip olup olmadıklarına bağlı olarak tarama için aday solucanları seçin. Bu işaretli solucanları OP50 ile yeni NG-agar plakalarına ayrı ayrı aktarın ve₂₀ °C'de F 2 soylarını döşemelerine izin verin.
          NOT: Ortak CRISPR taraması veya seçimi için kullanılan fenotip, Cas9 düzenlemenin başarısı için erken bir tahmin sağlamalıdır.
       2. Co-CRISPR fenotipi mevcut değilse, mikroenjeksiyon verimliliğini artırmaya yardımcı olmak için pozitif bir kontrol plazmidi mikroenject.
          NOT: Örneğin, mCherry etiketli MYO-2'yi kodlayan enjeksiyon karışımına bir plazmid dahil etmek enjeksiyon verimliliğini değerlendirmeye yardımcı olacaktır. pCFJ90 ile başarıyla enjekte edilen solucanların floresan farenksleri olan bazı yavruları olacaktır.
    5. İstenen düzenlemelerin varlığı için F₁ solucanlarını inceleyin. F₁ annesini 96 kuyulu bir plakanın tek bir kuyusuna seçin, onu haline getirin ve DNA'sını kesici uçlara özgü PCR amplifikasyonu, DNA dizi analizi veya eksper nükleaz testi (CEL-1) ile inceleyin.
       NOT: Bu tahliller, bir co-CRISPR/co-conversion veya diğer tarama veya seçim rejimleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Representative Results

Tablo 1: Ön genom düzenleme deneyleri için pozitif kontroller. Bu tablo, bu protokolde açıklanan hücrelerin ve organizmaların her birinde ilk kez genom düzenleme denemesi gerçekleştirmek için gereken temel bilgileri gösterir. Bu parametrelerin ardından, deneyci kendi çıkarlarını taşıyan bir geni hedefledikten sonra protokolü test etmek veya karşılaştırma için bir temel olarak kullanılabilecek başarılı bir sonuç vermesi muhtemeldir. F: ileri, R: ters, HDR: homolojiye yönelik onarım. Bu tablonun daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen burayı tıklatın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar