Microiniezione Gonad: Un metodo di consegna composta direttamente nella linea germinale di C. elegans

Overview

Questo video descrive la microiniezione, un metodo comune per creare ceppi transgenici di C. elegans.   Nell'esempio, vedremo la microiniezione utilizzata per introdurre un complesso di ribonucleoproteina (RNP) per l'editing genico delle basi CRISPR.

Protocol

Il seguente protocollo è un estratto da Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.

1. Assemblaggio RNP

1. Progetta l'esperimento con largo anticipo, acquisendo tutti i componenti dell'RNA, del DNA e delle proteine in anticipo. Come primo passaggio, prova uno dei controlli positivi elencati nella tabella 1 e utilizza i reagenti commerciali descritti nella tabella dei materiali per garantire una progettazione sperimentale affidabile e l'integrità dei materiali. Per ulteriori suggerimenti sulla pianificazione di un nuovo esperimento di modifica del genoma, vedere i documenti su questo argomento.
   NOTA: Una volta assemblati come descritto nelle fasi successive, gli RRN preparati in anticipo possono essere conservati a -80 °C.
   1. Dopo aver scelto quale gene scegliere, utilizzare uno degli strumenti online gratuiti per progettare un gRNA ottimale. Assicurati di prendere di mira un esone se speri di generare un knockout.
      NOTA: Questi strumenti aiuteranno a identificare un sito di destinazione con una sequenza PAM S. pyogenes adiacente, un punteggio di alta qualità e un punteggio basso fuori bersaglio.
   2. Purificare la proteina S. pyogenes Cas9 attraverso metodi pubblicati o acquistarla da un fornitore commerciale.
   3. Preparare un tipico tampone Cas9 per la diluizione dell'RNA, la preparazione RNP e la conservazione delle proteine, che contiene 20 mM di HEPES pH 7,5, 150 mM di KCl, 10% glicerolo e 1 mM di TCEP. Utilizzare sempre acqua priva di nucleasi nei tamponi che verranno utilizzati per rimescolare o diluire l'RNA per prevenire la degradazione.
   4. Produrre l'RNA guida (tracrRNA e crRNA o sgRNA) attraverso una trascrizione in vitro utilizzando metodi pubblicati, o acquistarlo da una società di sintesi di acido nucleico.
   5. Se si inserisce un gene, sintetizzare o acquistare un modello di DNA donatore.
   6. Conservare le aliquote proteiche e RNA a -80 °C e scongelarsi sul ghiaccio immediatamente prima dell'uso.
      NOTA: Ogni congelamento-scongelamento abbassa leggermente l'efficienza. Protocolli dettagliati e ad accesso aperto per la purificazione Cas9 e la trascrizione in vitro di sgRNA sono disponibili altrove.
2. Preparazione RNP per C. editing elegans: Assemblare il complesso RNP aggiungendo i seguenti reagenti al fine di creare un volume finale di 20 μL (le concentrazioni finali sono nottate tra parentesi): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) e i modelli di riparazione se necessario (0,5 μM ssDNA o fino a 350 ng/μL dsDNA).
   NOTA: L'efficienza di una riparazione basata su DSB mediata da Cas9 è proporzionale alla concentrazione del costrutto di riparazione dsDNA; pertanto, maggiore è la concentrazione del modello di riparazione, più efficiente è la riparazione su modelli. Tuttavia, un'iniezione di miscele contenenti più di 350 ng/μL di dsDNA ha dimostrato di ridurre la vitalità dei vermi iniettati. Pertanto, è meglio utilizzare fino a, ma non più di 350 ng / μL di dsDNA nel mix per massimizzare l'efficienza di riparazione riducendo al minimo la sua letalità.
   1. Aggiungi più crRNA per indirizzare più loci contemporaneamente, se necessario per l'approccio di screening co-CRISPR/co-conversione. Quando si aggiungono più di un crRNA, aggiungere ciascuno in sequenza al mix master.
      NOTA: La quantità di ogni crRNA non deve essere la stessa, e anche raddoppiare la concentrazione totale di crRNA nel mix principale senza modificare la concentrazione di Cas9 non sembra interferire con la frequenza della mutagenesi in un luogo specifico. Esempi sono descritti in dettaglio in Paix et al.
   2. Mescolare con pipettazione e far girare la soluzione RNP a 16.000 x g per 5 s per assicurarsi che la soluzione sia raccolta nella parte inferiore del tubo.
   3. Incubare la soluzione a 37 °C per 15 m.
   4. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 1 minuto per pellettare qualsiasi particolato in grado di ostruire l'ago di microiniezione annoiato sottile. Utilizzare il supernatante nei passaggi successivi.
3. C. Preparazione elegans

1. 1 giorno prima della microiniezione: Preparare le pastiglie di agarosio per la microiniezione.

1. Fare una soluzione di agarosio al 3% (w/v) in acqua aggiungendo agarosio all'acqua e portando la soluzione a ebollizione su una piastra calda o in un forno a microonde.
2. Disporre 24 mm x 50 mm x 1,5 mm coprire vetrini su un tavolo e utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per posizionare una piccola (~15 μL) goccia di soluzione di agarosio sullo scivolo. Appiattisci rapidamente la goccia di agarosio posizionando un altro coverslip sopra. Lasciare solidificare l'agarosio e quindi rimuovere uno dei copripasta.
3. Lasciare asciugare il coverslip rivestito di agarosio a faccia in su un piano del tavolo durante la notte. Dopo 24 ore, conservare i cuscinetti di agarosio in un contenitore pulito e asciutto.
   NOTA: Questi possono essere utilizzati a tempo indeterminato.

2. Tirare gli aghi di microiniezione: utilizzando capillari di vetro borosilicato con filamenti (diametro esterno 1,0 mm e diametro interno 0,58 mm), tirare gli aghi a base di Mello e Fire⁵⁷ e altre risorse. Gli aghi possono essere utilizzati immediatamente o possono essere conservati in un contenitore pulito e asciutto, rinforzato da supporti di argilla.

3. Per il mantenimento dei vermi, preparare un agar Nematode Growth Media (NGM) versato nelle piastre di Petri e avvistato con batteri OP50 (per protocolli sulla manutenzione standard di C. elegans e ricette per i mezzi di crescita, vedi Stiernagle).

4. Striare i vermi per la microiniezione: 12-24 ore prima della microiniezione, raccogliere gli ermafroditi messi in scena L4 su una nuova piastra NG-agar con batteri OP50 e incubarli durante la notte a 20 °C. Per ogni miscela target/iniezione Cas9, raccogliere ~ 30 vermi sulla piastra.

4. Giorno di microiniezione: Caricare l'ago di microiniezione tirato con il supernatante della soluzione RNP preparato nella fase 1.2.
   1. Pipettare il supernatante dal passaggio 1.2.4 in una pipetta capillare tirata e riempire la soluzione dalla pipetta capillare nell'ago di microiniezione preparato (generalmente caricando meno di 0,1 μL).
5. Montare l'ago caricato sull'apparato di microiniezione collegato a un micromanipolatore. Impostare la pressione dell'apparato di iniezione su 250 kPa e la pressione di bilanciamento a 25 kPa.
6. Rompere la punta dell'ago caricata per generare un bordo affilato dell'ago. Posizionare una coverlip quadrata da 15 mm x 15 mm x 1,5 mm sulla parte superiore di un coverslip da 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
   1. Sovrapporre un bordo della coverslip quadrata con olio di alocarbonio 700.
   2. Posizionare l'ago nell'olio, sul bordo del coperchio quadrato da 15 mm.
   3. Utilizzando una mano per guidare lo stadio del microscopio e il coverslip, spazzolare lo scivolo verso l'alto e lungo il bordo dell'ago mentre si deprime il pedale / pulsante di iniezione. Rompere la punta dell'ago indietro, aumentando il flusso del liquido dall'ago. Ottenere una portata ottimale facendo scorrere la miscela di iniezione lungo il bordo dell'ago, formando ~1 bolla/s.
7. Verificare che i vermi L4 raccolti 12-24 ore prima della microiniezione siano giovani adulti messi in scena per lo sviluppo il giorno dell'iniezione. Scegli i giovani vermi adulti su una piastra NG-agar priva di batteri OP50 e consenti loro di strisciare per 5 minuti. Ciò riduce la quantità di batteri trasferiti sul cuscinetto di iniezione, riducendo al minimo gli zoccoli dell'ago.
8. Posizionare un tampone di iniezione di agarosio/coverslip su un mirino di dissezione. Usando un piccone, posare una piccola traccia di olio di alocarbonio lungo un bordo del pad.
9. Usando il piccone rivestito di olio, sollevare diversi vermi dalla piastra NG-agar e nella pista dell'olio. Con i capelli fini attaccati a una pipetta, come una ciglia o un baffo di gatto, posizionare i vermi in parallelo, spingendo delicatamente i vermi nel tampone di agarosio. Fino a quando non è comodo con la procedura di microiniezione, montare e iniettare solo un verme alla volta.
   NOTA: L'agarosio secco assorbe l'umidità dai vermi, facendoli aderire al tampone. Di conseguenza, si deve lavorare rapidamente in quanto i vermi possono essiccare.
   1. Una volta in posizione e attaccati al pad, sovrapporre i vermi con altre poche gocce di olio di alocarbonio (~ 20 μL) dalla punta del piccone del verme.
10. C. elegans Gonad Microiniezione con RSP e assistenza post-iniezione
    Il protocollo di microiniezione è adattato da Mello e Fire e descritto in dettaglio altrove.
    1. Posizionare il coperchio con i vermi montati sul microscopio a iniezione. Con un basso ingrandimento (obiettivo 5X, 10X oculare), posizionare i vermi perpendicolarmente all'ago di iniezione.
       1. Passare a un ingrandimento elevato (obiettivo 40X, 10X oculare), riposizionare l'ago adiacente al braccio gonad corrispondente alla regione vicino ai nuclei a metà-tardo pachytene.
       2. Usando il micromanipolatore, spostare l'ago contro il verme, deprimendo leggermente la cuticola. Quindi, con una mano, tocca il lato del palco del microscopio per scuotere l'ago attraverso la cuticola. Premere il pedale/pulsante di iniezione e riempire lentamente il braccio gonad con la miscela di iniezione e rimuovere l'ago.
       3. Ripetere questo passaggio con l'altro braccio gonad.
    2. Una volta iniettati i vermi, rimuovere il tampone coverslip/agarosio e posizionarlo al microscopio di sezionamento.
       1. Utilizzando una pipetta capillare tirata, spostare l'olio dai vermi tubazionando un tampone M9 su di essi. Eseguire questo trattamento per rilasciare i vermi dall'agar.
       2. Dopo 10 minuti, quando i vermi si stanno thrashing nel tampone, spostarli su una piastra NG-agar con batteri OP50 usando la pipetta capillare tirata. Posizionare la piastra a 20 °C per 2-3 ore fino a quando i vermi non si sono ripresi e si stanno muovendo.
    3. Una volta recuperati, trasferire singolarmente i vermi su piastre NG-agar con OP50 e trasferire le piastre in un incubatore a 25 °C.
    4. Lasciare crescere ivermi iniettati da P₀e deporre la progenie per 3 giorni. Scherma la prole F_1.
       1. Se si utilizza co-CRISPR o co-conversione, selezionare i worm candidati per lo screening in base al fatto che abbiano il fenotipo mutante del gene di riferimento. Trasferire singolarmente questi vermi marcati in nuove piastre NG-agar con OP50 e consentire loro di posare la progenie F₂ a 20 °C.
          NOTA: Il fenotipo utilizzato per uno screening o una selezione co-CRISPR dovrebbe fornire una stima precoce del successo della modifica Cas9.
       2. Se il fenotipo co-CRISPR non è presente, microiniettare un plasmide di controllo positivo per aiutare a migliorare l'efficienza della microiniezione.
          NOTA: Ad esempio, includere un plasmide nella miscela di iniezione che codifica mCherry-tagged MYO-2 aiuterà a valutare l'efficienza di iniezione. I vermi iniettati con successo con pCFJ90 avranno una prole con faringe fluorescenti.
    5. Esaminare i worm F₁ per verificare la presenza delle modifiche desiderate. Scegli la madre F₁ su un pozzo individuale di una piastra da 96 po ', liscila ed esamina il suo DNA mediante amplificazione PCR specifica dell'inserto, analisi della sequenza del DNA o saggio di nucleasi del geometra (CEL-1).
       NOTA: Questi test possono essere eseguiti quando si utilizza un co-CRISPR / co-conversione o altri regimi di screening o selezione.

Representative Results

Tabella 1: Controlli positivi per esperimenti preliminari di modifica del genoma. Questa tabella mostra le informazioni chiave necessarie per eseguire un esperimento di editing del genoma per la prima volta in ciascuna delle cellule e degli organismi descritti in questo protocollo. Seguendo questi parametri è probabile che produca un risultato positivo che può essere utilizzato per testare il protocollo o come linea di base per il confronto una volta che lo sperimentatore sta prendendo di mira un gene di loro interesse. F: avanti, R: inverso, HDR: riparazione diretta dall'omologia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar