Microinjection des oisons : une méthode d’administration de composés directement dans la germline de C. elegans

Overview

Cette vidéo décrit la microinjection, une méthode courante de création de souches transgéniques de C. elegans.   Dans l’exemple, nous verrons la microinjection utilisée pour introduire un complexe de ribonucléoprotéines (RNP) pour l’édition des gènes CRISPR-bases.

Protocol

Le protocole suivant est un extrait de Farboud et coll., Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018).

1. Assemblée RNP

1. Concevez l’expérience bien à l’avance, en acquérant à l’avance tous les composants arn, ADN et protéines. Dans un premier temps, essayez l’un des contrôles positifs énumérés dans le tableau 1 et utilisez les reagents commerciaux décrits dans le Tableau des matériaux pour assurer une conception expérimentale fiable et l’intégrité des matériaux. Pour obtenir des conseils supplémentaires sur la planification d’une nouvelle expérience d’édition du génome, consultez les articles sur ce sujet.
   REMARQUE: Une fois assemblés comme décrit dans les étapes suivantes, les PNR préparés à l’avance peuvent être stockés à -80 °C.
   1. Après avoir choisi quel gène cibler, utilisez l’un des outils en ligne gratuits pour concevoir un ARN gRNA optimal. Assurez-vous de cibler un exon si vous espérez générer un KO.
      REMARQUE: Ces outils aideront à identifier un site cible avec une séquence PAM adjacente de S. pyogenes, un score de haute qualité et un faible score hors cible.
   2. Purifier la protéine S. pyogenes Cas9 par des méthodes publiées ou l’acheter auprès d’un fournisseur commercial.
   3. Préparez un tampon Cas9 typique pour la dilution de l’ARN, la préparation du RNP et le stockage des protéines, qui contient 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de KCl, 10% de glycérol et 1 mM de TCEP. Utilisez toujours de l’eau sans nucléase dans les tampons qui seront utilisés pour résuspendre ou diluer l’ARN pour prévenir la dégradation.
   4. Produire l’ARN guide (tracrRNA et crRNA ou sgRNA) par une transcription in vitro en utilisant des méthodes publiées, ou l’acheter auprès d’une société de synthèse d’acide nucléique.
   5. Si vous insérez un gène, synthétisez ou achetez un modèle d’ADN donneur.
   6. Conserver les aliquots protéiques et ARN à -80 °C et décongeler sur la glace immédiatement avant l’utilisation.
      REMARQUE: Chaque gel-dégel réduit légèrement l’efficacité. Des protocoles détaillés en libre accès pour la purification de Cas9 et la transcription in vitro des SGARN sont disponibles ailleurs.
2. Préparation RNP pour C. édition elegans : Assembler le complexe RNP en ajoutant les reagents suivants afin de créer un volume final de 20 μL (les concentrations finales sont notées entre parenthèses) : Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM), et les modèles de réparation si nécessaire (0,5 μM ssDNA ou jusqu’à 350 ng/μL dsDNA).
   REMARQUE: L’efficacité d’une réparation à modèle DSB à base de Cas9 est proportionnelle à la concentration de la construction de réparation dsDNA; ainsi, plus la concentration du modèle de réparation est élevée, plus la réparation modélisée est efficace. Cependant, il a été démontré qu’une injection de mélanges contenant plus de 350 ng/μL de dsDNA réduit la viabilité des vers injectés. Ainsi, il est préférable d’utiliser jusqu’à, mais pas plus de 350 ng /μL de dsDNA dans le mélange pour maximiser l’efficacité de réparation tout en minimisant sa létalité.
   1. Ajoutez plusieurs crARN pour cibler plusieurs loci simultanément, au besoin pour l’approche de dépistage co-CRISPR/co-conversion. Lors de l’ajout de plus d’un crRNA, ajouter chaque séquentiellement au mélange maître.
      REMARQUE: La quantité de chaque CRRNA n’a pas besoin d’être la même, et même doubler la concentration totale de crARN dans le mélange principal sans changer la concentration de Cas9 ne semble pas interférer avec la fréquence de la mutagenèse à un locus spécifique. Des exemples sont décrits en détail dans Paix et coll.
   2. Mélanger par pipetage et faire tourner la solution RNP à 16 000 x g pendant 5 s pour s’assurer que la solution est recueillie au fond du tube.
   3. Incuber la solution à 37 °C pour 15 m.
   4. Centrifugeuse l’échantillon à 16.000 x g pendant 1 min pour pelleter tous les particules qui pourraient obstruer l’aiguille de microinjection mince-ennuyée. Utilisez le supernatant dans les étapes suivantes.
3. Préparation C. elegans

1. 1 jour avant la microinjection : Préparez les coussinets d’agarose pour la microinjection.

1. Faire une solution d’agarose de 3 % (w/v) dans l’eau en ajoutant de l’agarose à l’eau et en portant la solution à ébullition sur une plaque chaude ou au micro-ondes.
2. Disposer des glissières en verre de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm sur une table et utiliser une pipette Pasteur en verre pour placer une petite goutte (~15 μL) de solution d’agarose sur la glissière. Aplatissez rapidement la goutte d’agarose en plaçant un autre coverslip sur le dessus. Laissez l’agarose se solidifier, puis retirez l’un des coverslips.
3. Laissez sécher le coverslip recouvert d’agarose sur une table toute la nuit. Après 24 h, conserver les coussinets d’agarose dans un contenant propre et sec.
   REMARQUE: Ceux-ci peuvent être utilisés indéfiniment.

2. Tirez sur les aiguilles de microinjection : à l’aide de capillaires en verre borosilicate avec filaments (diamètre extérieur de 1,0 mm et diamètre intérieur de 0,58 mm), tirez les aiguilles à partir de Mello et fire^{57 et} d’autres ressources. Les aiguilles peuvent être utilisées immédiatement ou peuvent être stockées dans un récipient propre et sec, soutenu par des supports en argile.

3. Pour l’entretien des vers, préparer une gélose Nematode Growth Media (NGM) versée dans des plaques de Pétri et repérée avec des bactéries OP50 (pour les protocoles sur l’entretien standard de C. elegans et les recettes pour les supports de croissance, voir Stiernagle).

4. Mettre en scène les vers pour la microinjection: 12-24 h avant la microinjection, choisir les hermaphrodites L4-mis en scène à une nouvelle plaque NG-agar avec des bactéries OP50 et les incuber pendant la nuit à 20 °C. Pour chaque mélange cible/injection Cas9, choisissez ~30 vers à la plaque.

4. Jour de microinjection : Chargez l’aiguille de microinjection tirée avec le supernatant de solution RNP préparé à l’étape 1.2.
   1. Pipette le supernatant de l’étape 1.2.4 dans une pipette capillaire tirée et remblayer la solution de la pipette capillaire dans l’aiguille de microinjection préparée (chargement généralement inférieur à 0,1 μL).
5. Monter l’aiguille chargée sur l’appareil de microinjection attaché à un micromanipulateur. Réglez la pression de l’appareil d’injection à 250 kPa et la pression d’équilibre à 25 kPa.
6. Casser la pointe de l’aiguille chargée pour générer un bord d’aiguille tranchant. Placez un coverslip carré de 15 mm x 15 mm x 1,5 mm sur le dessus d’un couvercle de 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
   1. Superposer un bord de la couverture carrée avec de l’huile d’halocarbone 700.
   2. Placez l’aiguille dans l’huile, au bord de la couverture carrée de 15 mm.
   3. À l’aide d’une main pour guider l’étape du microscope et le coverslip, brossez la glissière vers le haut et le long du bord de l’aiguille tout en déprimant la pédale/bouton d’injection. Casser la pointe de l’aiguille en arrière, augmentant le flux du liquide hors de l’aiguille. Obtenez un débit optimal en faisant couler le mélange d’injection le long du bord de l’aiguille, formant ~1 bulle/s.
7. Confirmer que les vers L4 cueillis 12-24 h avant la microinjection sont mis en scène par développement jeunes adultes le jour de l’injection. Choisissez les jeunes vers adultes dans une plaque ng-agar qui n’a pas de bactéries OP50 et laissez-les ramper pendant 5 min. Cela réduit la quantité de bactéries transférées sur la plaquette d’injection, minimisant ainsi les sabots d’aiguille.
8. Placer un tampon d’injection d’agarose/coverslip sur une portée de dissection. À l’aide d’un pic de ver, déposer une petite trace d’huile d’halocarbone le long d’un bord de la garniture.
9. À l’aide du pic de ver enduit d’huile, soulevez plusieurs vers de la plaque NG-agar et entrez dans la piste de l’huile. Avec un cheveu fin attaché à une pipette, comme un cil ou une moustache de chat, placez les vers en parallèle, poussant doucement les vers dans la garniture d’agarose. Jusqu’à ce qu’il soit à l’aise avec la procédure de microinjection, ne montez et injectez qu’un ver à la fois.
   REMARQUE: L’agarose sèche évacue l’humidité des vers, les faisant adhérer à la garniture. Par conséquent, il faut travailler rapidement car les vers peuvent se desserquer.
   1. Une fois en position et attaché à la garniture, superposez les vers avec quelques gouttes d’huile d’halocarbone (~20 μL) de la pointe du pic de ver.
10. Microinjection de C. elegans Gonad avec RNPs et soins post-injection
    Le protocole de microinjection est adapté de Mello and Fire et décrit en détail ailleurs.
    1. Placez le coverslip avec les vers montés sur le microscope d’injection. Sous un faible grossissement (objectif 5X, oculaire 10X), placez les vers perpendiculairement à l’aiguille d’injection.
       1. Passez à un grossissement élevé (objectif 40X, oculaire 10X), repositionnez l’aiguille adjacente au bras de la 9nocène correspondant à la région près des noyaux dans le milieu à la fin du pachytene.
       2. À l’aide du micromanipulateur, déplacez l’aiguille contre le ver, déprimant légèrement la cuticule. Puis, d’une main, appuyez sur le côté du stade du microscope pour secouer l’aiguille à travers la cuticule. Déprimez la pédale/bouton d’injection et remplissez lentement le bras de la 9e avec le mélange d’injection et retirez l’aiguille.
       3. Répétez cette étape avec l’autre bras 9e.
    2. Une fois que les vers sont injectés, retirez la garniture de coverslip/agarose et placez-la sous un microscope disséquant.
       1. À l’aide d’une pipette capillaire tirée, déplacez l’huile des vers en faisant passer un tampon M9 au-dessus d’eux. Effectuez ce traitement pour libérer les vers de l’agar.
       2. Après 10 min, lorsque les vers se battent dans le tampon, déplacez-les vers une plaque ng-agar avec des bactéries OP50 à l’aide de la pipette capillaire tirée. Placez la plaque à 20 °C pendant 2-3 h jusqu’à ce que les vers se soient rétablis et se déplacent.
    3. Une fois récupérés, transférer individuellement les vers dans des plaques ng-agar avec OP50 et transférer les plaques dans un incubateur de 25 °C.
    4. Permettre aux vers_injectésP0 de croître et de ponder de la descendance pendant 3 jours. Filtrer la progéniture_{F 1.}
       1. Si vous utilisez co-CRISPR ou co-conversion, puis sélectionnez les vers candidats pour le dépistage en fonction de s’ils ont le phénotype mutant du gène de référence. Transférez individuellement ces vers marqués dans de nouvelles plaques ng-agar avec OP50 et permettez-leur de ponder la descendance F₂ à 20 °C.
          REMARQUE: Le phénotype utilisé pour un dépistage ou une sélection co-CRISPR devrait fournir une estimation précoce du succès de l’édition Cas9.
       2. Si le phénotype co-CRISPR n’est pas présent, microinjecter un plasmide de contrôle positif pour aider à améliorer l’efficacité de la microinjection.
          REMARQUE: Par exemple, l’inclusion d’un plasmide dans le mélange d’injection qui code le MYO-2 marqué par mCherry aidera à évaluer l’efficacité de l’injection. Les vers injectés avec succès avec pCFJ90 auront une progéniture avec des pharynxes fluorescents.
    5. Examinez les vers F₁ pour la présence des modifications souhaitées. Choisissez la mère F₁ à un puits individuel d’une plaque de 96 puits, lyse-elle, et d’examiner son ADN soit par l’amplification PCR spécifique insert, analyse de la séquence d’ADN, ou l’analyse de nucléase arpenteur (CEL-1).
       REMARQUE: Ces analyses peuvent être effectuées lors de l’utilisation d’un co-CRISPR/co-conversion ou d’autres régimes de dépistage ou de sélection.

Representative Results

Tableau 1 : Contrôles positifs pour les expériences préliminaires d’édition du génome. Ce tableau montre les informations clés nécessaires pour effectuer une première expérience d’édition du génome dans chacune des cellules et organismes décrits dans ce protocole. Suivre ces paramètres est susceptible de donner un résultat réussi qui peut être utilisé pour tester le protocole ou comme base de référence pour la comparaison une fois que l’expérimentateur cible un gène de leur propre intérêt. F: vers l’avant, R: inverse, HDR: réparation dirigée par homologie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette table.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents/Materials
DNA oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	-	IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs	Synthego	-	Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes)	New England Biosciences	M0646T	If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP-50	https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes	-	-	See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID	World Precision Instruments	1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID	World Precision Instruments	1B200-6
Cover glass; 24 × 50 mm	Thermo Fisher Scientific	12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm	Thermo Fisher Scientific	12-518-105K
Apex LE agarose	Genesee Scientific	20-102
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
pCFJ90 plasmid	Addgene	19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)	World Precision Instruments	T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)	-
9" pasteur pipettes	-
Nuclease-free water	-
Equipment
MZ75 Stereomicroscope	Leica	Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope	Zeiss	Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol)	Sutter Instrument	FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol)	Warner Instruments	PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-202U
Coarse manipulator	Narishige International	MMN-1
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
NG-agar