الأشعة فوق البنفسجية: طريقة لدمج الصفائف خارج الكروموسومية

Overview

عادة ما يؤدي التجميل الدقيق للمتحولات إلى سلالات C. elegans ذات الصفائف الكبيرة خارج الكروموسومية ، مما يؤدي إلى التعبير المتغير وانتقال المتحول.  الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تحفز التكامل الكروموسومي من الصفيف وانتقال المتحولين أكثر استقرارا.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Mariol وآخرون، بروتوكول سريع لدمج الصفائف خارج الكروموسومية مع معدل انتقال عالية في الجينوم C. elegans ، J. Vis. Exp. (2013).

1. الأشعة فوق البنفسجية واستعادة الديدان المعدلة وراثيا

1. إشعاع الدودة:
   1. اختيار 30-100 الحيوانات الفلورية L4 المعدلة وراثيا على لوحات ثقافة منفصلة (15-20 الحيوانات حسب لوحة).
   2. ضع اللوحات، مع إزالة الأغطية، في وصلة عرضية للأشعة فوق البنفسجية. تشعيع الديدان في 0.012 J/cm². لاحظ أن السلالات أكثر أو أقل حساسية للأشعة فوق البنفسجية وأن النتائج يمكن أن تكون متغيرة اعتمادا على الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة. يمكن اختبار نطاق الجرعة بين 0.010-0.015 J/cm^2.
2. استعادة الدودة بعد التشعيع:
   1. وضع لوحات مع الديدان المشععة بين عشية وضحاها في 15 درجة مئوية للتعافي.
   2. تحقق من عدد الحيوانات التي هي على قيد الحياة. في أيدينا، معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 80-90٪ يتم تكييفها لإشعاع كفاءة.
   3. تنمو الحيوانات المشععة في 15-25 درجة مئوية حتى ذرية وصلت إلى مرحلة النمو مما يسمح لمراقبة التعبير علامة coinjection.

2. عزل الخطوط المعدلة وراثيا المتكاملة

1. اختيار الحيوانات F1:
   1. واحد 150-200 الحيوانات F1 الفلورسنت على لوحات ثقافة منفصلة. بالنسبة للخطوط عالية الإرسال (≥80٪) ، يكفي 100 F1.
   2. الحفاظ على هذه اللوحات F1 في 15-25 درجة مئوية حتى ذرية تصل إلى مرحلة مناسبة لمراقبة الحيوانات F2 الفلورسنت.
   3. تجاهل جميع لوحات F1 التي تظهر إما 1) لا ذرية، مما يشير إلى أن الحيوان F1 كان عقيما أو مات، أو 2) لا أو عدد قليل فقط من الحيوانات الفلورية F2، مما يشير إلى أن الحيوان F1 لم ينقل المتحول بالمعدل المتوقع. هذه الخطوة سريعة وتمثل ميزة حقيقية بالمقارنة مع البروتوكول القياسي الذي يتطلب تقدير النسبة المئوية للديدان الفلورية F2 من أجل تحديد لوحات F1 التي تعرض ذرية فلورية ≥75٪ (الجدول 1).
2. اختيار الحيوانات F2:
   1. واحد أربعة الحيوانات F2 المعدلة وراثيا الفلورسنت من كل لوحة F1 مختارة. عند استخدام المتحولات الفلورية (على سبيل المثال mCherry، gfp، أو dsRed)، اختر الديدان F2 مع مستوى عال من الفلورسنت لأن هذا يمكن أن يشير إلى أن هذه الحيوانات هي homozygous لمجموعة متكاملة. لاحظ أنه عند التقاط الحيوانات F2 من المهم عدم حمل البيض أو اليرقات ، من أجل تجنب السلبيات الكاذبة في الخطوة التالية.
   2. تنمو الحيوانات F2 في 15-25 درجة مئوية.
3. عزل السلالات المعدلة وراثيا المتكاملة والتحقق من صحتها:
   1. لوحات F2 الشاشة ل 100٪ الديدان F3 المعدلة وراثيا الفلورسنت. الشاشة سريعة جدا حيث يشير وجود دودة واحدة غير فلورية إلى أنه يجب التخلص من اللوحة. وF2 homozygous الحيوان للمتحول المتكاملة تعطي 100٪ homozygous ذرية الفلورسنت.
   2. واحد ثمانية الحيوانات F3 الفلورسنت من لوحات مختارة لتأكيد الميراث 100٪ من transgene. من الناحية النظرية ، واختيار واحد يكفي في هذه الخطوة. ومع ذلك، قد يكون من الضروري اختيار ثمانية فلورية من الفئة F3 لتجنب اختيار غير خاملة أو غير صحية لأن التشعيع يمكن أن يؤدي عشوائيا إلى طفرات تؤثر على الجينات المهمة لعلم وظائف الأعضاء الدودية.
   3. إذا كان ذلك ممكنا الحفاظ على العديد من السلالات المعدلة وراثيا المتكاملة المستقلة، أي سلالات تعافى من الحيوانات F1 مختلفة.

Representative Results

الجدول 1 - الجداول مقارنة بين البروتوكولات القياسية والمحسنة لدمج الصفائف خارج الكروموسومية فيجينوم C. elegans. وأدمج محولان متحولان غير صحيحين ينقلان بنفس التردد تقريبا باستخدام المعيار أو البروتوكول المحسن. ويكمن الفرق الرئيسي في حقيقة أنه في البروتوكول القياسي يتم إجراء شاشة من ذرية على جميع لوحات F1 لتقدير النسبة المئوية للديدان F2 المعدلة وراثيا، والتي ينبغي أن تكون ≥ 75٪. تستغرق هذه الخطوة وقتا طويلا ، خاصة إذا كان المعدل الأولي لانتقال العدوى قريبا من 75٪. في البروتوكول المحسن ، يكفي أن تكون أربع ديدان F2 واحدة من كل لوحة F1 تحمل F2 المعدلة وراثيا وفحص 100٪ من الديدان المعدلة وراثيا في السلف (F3) ، والتي يمكن إجراؤها بسرعة. تم تكييف البروتوكول القياسي.  

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms