UV-bestråling: En metode for å integrere ekstrakromosomale arrayer

Overview

Mikroinjeksjon av transgenes resulterer vanligvis i C. elegans stammer med store ekstrakromosomale matriser, noe som resulterer i variabelt uttrykk og overføring av transgene.  UV-bestråling kan indusere kromosomal integrasjon av matrisen og mer stabil transgene overføring.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Mariol et al, A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate i C. elegans Genome, J. Vis. Exp. (2013).

1. UV-bestråling og gjenoppretting av transgene ormer

1. Bestråling av ormer:
   1. Velg 30-100 fluorescerende transgene L4-dyr på separate kulturplater (15-20 dyr etter tallerken).
   2. Plasser platene, med lokkene fjernet, i en UV-krysskobling. Bestråle ormene ved 0,012 J/cm². Vær oppmerksom på at stammer er mer eller mindre følsomme for UV, og at resultatene kan variere avhengig av UV-bestråleren som brukes. Et doseområde mellom 0,010-0,015 J/cm² kan testes.
2. Ormgjenoppretting etter bestråling:
   1. Plasser plater med bestrålede ormer over natten ved 15 °C for gjenoppretting.
   2. Se etter antall dyr som er i live. I våre hender er en overlevelsesrate på rundt 80-90% tilpasset en effektiv bestråling.
   3. Dyrk de bestrålede dyrene ved 15-25 °C til avkommet har nådd utviklingsstadiet, noe som muliggjør observasjon av myntjeksjonsmarkøruttrykket.

2. Isolering av integrerte transgene linjer

1. Utvalg av F1 dyr:
   1. Enkelt 150-200 fluorescerende F1 dyr på separate kulturplater. For svært overførende linjer (≥80%), er 100 F1 dyr nok.
   2. Hold disse F1-platene ved 15-25 °C til avkommet når et passende stadium for observasjon av fluorescerende F2-dyr.
   3. Kast alle F1-plater som viser enten i) ingen avkom, noe som indikerer at F1-dyret var sterilt eller døde, eller ii) ingen eller bare få fluorescerende F2-dyr, noe som indikerer at F1-dyret ikke overførte transgene i forventet hastighet. Dette trinnet er raskt og representerer en reell fordel sammenlignet med standardprotokollen som krever en estimering av prosentandelen fluorescerende F2-ormer for å velge F1-plater som viser ≥75% fluorescerende avkom (Tabell 1).
2. Utvalg av F2 dyr:
   1. Enkelt fire fluorescerende transgene F2-dyr fra hver valgte F1-plate. Når du bruker fluorescerende transgenes (for eksempel mCherry, gfp eller dsRed), velg F2 ormer med høyt nivå av fluorescens, da dette kan indikere at disse dyrene er homozygote for den integrerte matrisen. Vær oppmerksom på at når du plukker F2 dyr, er det viktig å ikke bære med egg eller larver, for å unngå falske negativer i neste trinn.
   2. Vokse F2 dyr ved 15-25 °C.
3. Isolering og validering av integrerte transgene stammer:
   1. Skjerm F2 plater for 100% fluorescerende transgene F3 ormer. Skjermen er ganske rask da tilstedeværelsen av en enkelt ikke-påvirkende orm indikerer at platen skal kastes bort. En F2 dyr homozygot for den integrerte transgene vil gi 100% homozygot fluorescerende avkom.
   2. Enkelt åtte fluorescerende F3-dyr fra utvalgte plater for å bekrefte 100% arv av transgene. I teorien er det nok å velge ett dyr på dette trinnet. Imidlertid kan det være nødvendig å plukke åtte fluorescerende F3-dyr for å unngå å velge unfertile eller usunne dyr, da bestråling tilfeldig kan indusere mutasjoner som påvirker gener som er viktige for ormfysiologi.
   3. Hvis det er mulig, hold flere uavhengige integrerte transgene stammer, det vil si stammer gjenvunnet fra forskjellige F1-dyr.

Representative Results

Tabell 1. Sammenligning av standard og forbedrede protokoller for ekstrakroosomale arrays integrasjon i C. elegans genom. To ikke-integrated transgenes som sender med omtrent samme frekvens ble integrert ved hjelp av standarden eller den forbedrede protokollen. Hovedforskjellen ligger i det faktum at i standardprotokollen utføres en skjerm av avkom på alle F1-plater for å estimere prosentandelen av transgene F2-ormer, som skal være ≥ 75%. Dette trinnet tar lang tid, spesielt hvis overføringshastigheten er nær 75%. I den forbedrede protokollen er det tilstrekkelig å enkelt fire F2 ormer fra hver F1 plate som bærer transgene F2 dyr og å skjerme for 100% av transgene ormer i avkom (F3), som kan utføres raskt. Standardprotokollen er tilpasset.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.V. cross-linker	Fischer Scientific		Wavelength 254 nm
Microscope SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
Petri dishes, 60 mm	CML	BPS55E6
Platinium wire 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	To make a pick for worms