Summary
في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم طريقة لعزل واحد أو عدة
Abstract
وتشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية للنظام العصبي المحيطي ذبابة الفاكهة (PNS) توفير نظام نموذجا ممتازا للتحقيق فيها الآليات الجزيئية الكامنة وراء فئة محددة 1،2 تغصن التشكل. لتسهيل التحليلات الجزيئية لفئة محددة تنمية الخلايا العصبية دا ، فمن الأهمية بمكان الحصول على هذه الخلايا في السكان النقي. على الرغم من مجموعة من الخلايا المختلفة ، والأنسجة الخاصة العزلة تقنيات الحمض النووي الريبي وجود لخلايا ذبابة الفاكهة ، بما في ذلك تنقية خلية حبة المغناطيسي على 3،4 ، نيون الفرز الخلية المنشط (FACS) 5-8 ، والجيش الملكي النيبالي البروتين ملزمة تستند استراتيجيات 9 ، أي من ويمكن استخدام هذه الأساليب بسهولة لعزل واحد أو فئة محددة متعددة الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة مع وجود درجة عالية من الدقة المكانية. وقد برز الليزر Microdissection التقاط (LCM) كأداة قوية للغاية والتي يمكن استخدامها لعزل أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة المقاطع مع وجود درجة عالية من الدقة والقرار المكانية. ثم يمكن الحصول عليها من خلايا الحمض النووي الريبي معزولة يمكن استخدامها لتحليل بما في ذلك qRT - PCR وميكروأري التنميط التعبير ضمن نوع من الخلايا نظرا 10-16. حتى الآن ، LCM لم تطبق على نطاق واسع في تحليل الأنسجة والخلايا 17،18 ذبابة الفاكهة ، بما في ذلك الخلايا العصبية دا في المرحلة الثالثة اليرقات طور مرحلي للتنمية.
هنا نقدم لدينا بروتوكول الأمثل لعزل الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) فئة من LCM. هذا الأسلوب يسمح للقبض على واحد الخلايا العصبية ، دا فئة محددة أو متعددة مع خصوصية عالية والقرار المكانية. العمر المتطابقة اليرقات طور مرحلي يعبر عن UAS third - mCD8 : 19 GFP التحوير تحت سيطرة إما الصف الرابع دا الخلايا العصبية المحددة PPK - 20 GAL4 السائق أو لعموم دا عصبون محددة 21-7 GAL4 - 21 واستخدمت لهذه السائق التجارب. الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من الخلايا العصبية معزولة دا هو من نوعية عالية جدا ، ويمكن استخدامها مباشرة لتطبيقات المصب ، بما في ذلك qRT - PCR أو ميكروأري التحليلات. وعلاوة على ذلك ، يمكن هذا البروتوكول LCM تكييفه بسهولة لالتقاط أنواع الخلايا الأخرى ذبابة الفاكهة a مراحل مختلفة من التنمية تعتمد على نوع من الخلايا المحددة ، ونمط التعبير GAL4 يحركها من GFP.
Protocol
تعليقات عامة على LCM من ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية المحيطية
يسمح اعتبارا من 6 ساعات ، وتصل إلى أسبوع أو أكثر لLCM تبعا لنوع الأنسجة وعدد الخلايا المطلوبة.
تتم جميع الإجراءات في ظروف ريبونوكلياز خالية تماما وفقا للإجراءات القياسية. معربا عن اليرقات إما 21-7 - GAL4 ، UAS - mCD8 : GFP أو PPK GAL4 ، UAS - mCD8 : استخدمت خطوط GFP مراسل المعدلة وراثيا لهذه التجارب.
1. إعداد اليرقات
- ثم جمع عمر 30-40 المطابقة اليرقات طور مرحلي الثالث وغسلها في DDH 2 O التي يشطف وجيزة في ذهاب ريبونوكلياز (سيغما الدريخ) ، وغسل النهائي في DDH 2 O لإزالة ريبونوكلياز بعيدا. الفتيل قبالة الزائدة DDH 2 O تماما مع Kimwipe نظيفة قبل تضمين اليرقات في أكتوبر
- أخذ أنسجة نظيفة تضمين طبقة العفن وذلك مع طبقة (1.5 - 2mm و) رقيقة من أكتوبر ، وهو ما يكفي فقط لتغطية طبقة واحدة من اليرقات.
- قبل تضمين اليرقات ، إذا لزم الأمر ، تبريد أكتوبر إلى 0 درجة مئوية في قوالب تضمين الأنسجة. القيام بذلك عن طريق وضع قالب يحتوي أكتوبر على كتلة من الجليد. وهذا سيساعد على الحد من حركة اليرقات أثناء عملية التضمين.
- وضع اليرقات نظيفة في أكتوبر قبل تبريده وترتيبها بالتوازي مع بعضها البعض. مرة واحدة وقد رتبت اليرقات ، وملء القالب ببطء مع أكتوبر من دون إزعاج الترتيب اليرقات. المفاجئة تجميد العفن بوضعه على كتلة الثلج الجاف. [خطوة حاسمة : أداة إضافية تجميد اليرقات على الفور للحد من حركة] وهذه الطريقة تسمح لليرقات ليكون في طائرة واحدة ، وتعظيم عدد الخلايا المتاحة لكل قسم للاعتقال.
إذا كان ذلك ضروريا للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة لتحديد الخلايا في المصالح ، أو إذا تم العثور على العدد المتوقع من الخلايا في القسم ليكون مرضيا ثم الشروع مباشرة إلى الخطوة 11.
بدلا من ذلك إذا كنت قد وصفت الخلايا على وجه التحديد ، ويمكن تحديدها مع علامة يسهل التعرف عليها مثل GFP أو طلب تقديم العروض ، ولكن تم العثور على عدد من الخلايا في القسم لتكون منخفضة ، ثم 50-10 خطوات يكون من المفيد لزيادة عدد الخلايا المتاحة لالتقاط كل مقطع. هذه هي الخطوات اختياري ، وينبغي النظر فيها إلا إذا لزم الأمر ، كوسيلة لزيادة عدد الخلايا العصبية دا المتاحة لLCM في القسم عندما فشل في طريقة أخرى لتقديم نتائج إيجابية. [تحذير : هذا الأسلوب قد يعطل التشكل الأنسجة العام وجعل النسيج على أساس تحديد الموقع المكاني محددة صعبة جدا.]
- يغسل 50-70 اليرقات طور مرحلي الثالثه المشار كما في الخطوة 1. وضع اليرقات في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 500 microfuge ميكرولتر من ريبونوكلياز 1X PBS الحرة.
- Dounce اليرقات باستخدام مدقة البولي بروبلين (الولايات المتحدة الأمريكية العلمية) ، مع ضربات قوية 6-7 بطيئة.
- الحل في أجهزة الطرد المركزي 16000 (خ) ز ثوان 50-10 (حتى البشرة اليرقات تستقر في قاع الأنبوب microfuge]. تخلص من طاف. بيليه وينبغي أن تتألف أساسا من إهاب اليرقات التي تكون الجهاز العصبي المحيطي ، بما في ذلك الخلايا العصبية دا ، هو التقيد باحكام.
- غسل بشرة بيليه 2-3 مرات في برنامج تلفزيوني و1X resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني في 500 1X ميكرولتر. تدور في حل 16000 (خ) ز ل 1 دقيقة لتشكيل بيليه المضغوط. وطاف به نضح تماما غرامة باستور ماصة.
- إزالة بعناية بيليه من أنبوب microfuge باستخدام ملعقة نظيفة ، والفتيل قبالة PBS الزائدة باستخدام الأنسجة Kimwipe نظيفة. [ملاحظة : من المهم للحفاظ على بيليه وضغط ممكن لزيادة الغلة الخلية]. مكان التعاقد إهاب بيليه على قالب من البلاستيك تحتوي على طبقة رقيقة من أكتوبر (1MM تقريبا).
- انتشار برفق بيليه في منطقة دائرية رقيقة. ملء القالب مع أكتوبر ، وتجميد الأنسجة كما هو موضح في الخطوة 4.
- باستخدام ناظم البرد ، وقطع الأجزاء المجمدة في سمك ميكرومتر 5-8 يوم عادي ، المسمى ، بدون تهمة ، ريبونوكلياز حرة المجهر الشرائح الزجاجية. [خطوة حاسمة : موقف المقاطع الأنسجة بالقرب من مركز الشريحة.]
- تخزين الشرائح إما مباشرة على الثلج الجاف ، أو على -80 درجة مئوية في الشريحة نظيفة حتى علبة جاهزة للmicrodissection. أداء LCM يفضل في غضون أسبوع بعد sectioning الأنسجة.
PAUSE POINT
2. جفاف البشرة وإزالة اليرقات من الأقسام مجمدة
[خطوة حاسمة : يجب أن يكون مستعدا لجميع الحلول الجفاف قبل كل دورة جديدة LCM. الجفاف الكامل للأقسام الأنسجة المجمدة اليرقات أمر ضروري لتحقيق الكفاءة المثلى microdissection]
- إزالة الشرائح التي تحتوي على أقسام الأنسجة المجمدة من الفريزر اليرقات -80 درجة مئوية ووضعها على الثلج الجاف.
- إزالة شريحة واحدة من الثلج الجاف والمكان على الفور مباشرةفي أنبوب مخروطي 50 مل مملوءة تثبيتي الايثانول 70 ٪ ، تليها قصيرة مجانا في شطف ريبونوكلياز O 2 DDH وفقا لأوقات أوصت الواردة في الجدول 1.
- قد وجود بشرة اليرقات في الفروع المجمدة تضعف كفاءة من خلال منع التقاط كفاءة LCM غطاء خلية الاتصال والتي قد تؤدي إلى القبض على غير محددة. إذا لزم الأمر ، وإجراء الخطوات التالية (4-5) لمسح إهاب من أبواب الأنسجة.
- 50 ماصة بلطف ميكرولتر من التربسين 2.5 ٪ مباشرة على المقاطع الأنسجة واحتضان 5-30 ثوان في درجة حرارة الغرفة. [خطوة حاسمة : هذه الخطوة قد تتطلب التحسين. فترة حضانة يعتمد على الأنسجة لتكون microdissected وسمك الباب. قد يعد حضانة واضحة كل شيء بما في ذلك خلايا الفائدة ، في حين أن حضانة قصيرة قد لا تكون كافية لإزالة إهاب]
- شطف لفترة قصيرة في المقاطع المخروطية أنبوب 50 مل تحتوي على ريبونوكلياز خالية DDH 2 O لإزالة التربسين ، وشظايا إهاب انضمت فضفاضة.
- تراجع الشرائح بالتتابع في كل من الايثانول المتبقية والحلول الزيلين للمرة موصى بها (الجدول 1) لإكمال عملية الجفاف.
- بعد التدرج الجفاف ، ويتم تجفيفها لفترة وجيزة الشرائح تحت تيار الهواء الخفيف ل60-120 ثانية في درجة حرارة الغرفة قبل أداء LCM. [تحذير : جفف الزيلين تماما من المقاطع الأنسجة قبل تنفيذ LCM. ومن المعروف الزيلين حل سقف LCM البوليمر الذي أدى الى فشل microdissection].
| 70 ٪ إيثانول (مثبت) | 30-10 ثانية |
| DDH 2 O | 50-10 ثانية |
| 2.5 ٪ التربسين الحضانة | 50-30 ثانية |
| DDH 2 O | 50-10 ثانية |
| 70 ٪ إيثانول | 60 ثانية |
| 95 ٪ إيثانول | 60 ثانية |
| الإيثانول بنسبة 100 ٪ | 120 ثانية |
| الإيثانول بنسبة 100 ٪ | 120 ثانية |
| 100 ٪ الزيلين | 120 ثانية |
| 100 ٪ الزيلين | 120 ثانية |
| الهواء الجاف في تيار هواء خفيف | 60-120 ثانية |
الجدول رقم 1 : إجراءات الموصى بها للجفاف LCM من أقسام الأنسجة المجمدة اليرقات.
3. الليزر التقاط Microdissection
تم استخدام أداة PixCell LCM IIE مجهزة البصريات 300 فلور epifluorescence الأمثل لEGFP لأداء LCM.
[خطوة حاسمة : إذا كان ذلك ممكنا ، نفذ microdissection في غرفة الرطوبة التي تسيطر عليها لمنع أي انخفاض في كفاءة microdissection بسبب زيادة الرطوبة. الرطوبة الغرفة هو عامل حيوي يؤثر على كفاءة microdissection. الرطوبة المنخفضة يمكن أن يتسبب في زيادة الغرفة ثابتة ، مما أدى إلى التشبث غير محددة اعتقال ، بينما الرطوبة العالية يمكن أن يؤدي إلى غرفة microdissection الكفاءة المنخفضة. حققنا الكفاءة المثلى بين 25-50 ٪ LCM ظروف الرطوبة النسبية.]
- بدوره على السلطة للمجهر والليزر مربع التحكم.
- تحميل صاحب غطاء التجمع CapSure مع HS LCM القبعات (الأجهزة الجزيئية) : لا يجوز تحميل خراطيش اثنان من القبعات LCM في وقت واحد.
- فتح البرمجيات والأجهزة الجزيئية أدخل في تفاصيل التجربة بما في ذلك رقم الشريحة والعدد الكثير رسملة.
- تحميل جديد كأب LCM HS من خرطوشة على الصك PixCell LCM IIE وضعه بشكل صحيح فيما يتعلق عصا التحكم لضمان تحديد المواقع المناسبة للغطاء في ما يتعلق المنطقة الالتقاط.
- ضع شريحة المجهر المجففة تحتوي على أقسام حديثا الأنسجة اليرقات على المسرح لmicrodissection المجهر.
- تحديد الخلايا fluorescently المسمى باستخدام oculars أو على شاشة الكمبيوتر. نظرا لخصوصية عالية من PPK - GAL4 ، UAS - mCD8 : : خط GFP مراسل المعدلة وراثيا ، يمكن أن الخلايا العصبية في الصف الرابع دا التعرف عليها بسهولة من قبل مضان GFP.
- موضوع النسيج إلى استخدام LCM CapSure HS LCM القبعات [لمجموعة من التعليمات التفصيلية لوضع الصك ، مع التركيز على الليزر وأداء LCM أنظر المرجع 22].
- ضبط "السلطة" و "المدة" نبضة ليزر المعلمات لتحقيق دقيق بقعة البوليمر المنصهر ، الذي يتوافق مع حجم حجم بقعة الليزر المحدد. ضبط الإعدادات لتخصيص حجم منطقة البوليمر المنصهر. استخدمت المعايير التالية لفئة واحدة microdissecting الرابع دا الخلايا العصبية : القطر 7.5 ميكرومتر سبوت ، وقوة الليزر 30-50 ميغاواط ، والوقت ليزر و2-4 مللي وق 1-2واستخدمت hots لكل خلية. [خطوة حاسمة : المعلمات المطلوبة ليزر بقعة مناسبة قد تختلف مع سمك النسيج وظروف الرطوبة الغرفة. ضبط "السلطة" و "المدة" لتحقيق الضبط المطلوب بقعة البوليمر ذاب حجم microdissecting خلايا مفردة أو متعددة.]
- لتحقيق أقصى قدر من التحديد ، microdissect الخلايا مع الحد الأدنى من التداخل ومضان قوية. سقف كل قادر على التقاط العديد من الهيئات الخلية. [خطوة حاسمة : لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي ، والحد من الوقت التحليل الكلي بما في ذلك الجفاف وmicrodissection إلى أقل من 45 دقيقة]
- مرة واحدة وقد تم القبض على كافة الخلايا من الفائدة ، ورفع سقف LCM HS مع الخلايا microdissected وضعها على شريحة نظيفة لتأكيد وجود الخلايا والقبض والتفتيش بصريا الغطاء عن وجود خلايا غير مرغوب فيها أو الحطام.
4. بمعزل عن الحمض النووي الريبي LCM الخلايا المشتقة
- نعلق الغطاء الذي يحتوي على خلايا microdissected إلى جهاز (الأجهزة الجزيئية) ExtracSure. إضافة 12μl من الحمض النووي الريبي استخراج العازلة (PicoPure ، الأجهزة الجزيئية) على سطح الغطاء الذي يحتوي على الخلايا وتوصيل أنبوب مقلوب رد فعل رقيقة الجدران (GeneAmp ، النظم البيولوجية التطبيقية) إلى الجهاز ExtracSure. مكان التجمع على درج المحاذاة (الأجهزة الجزيئية) وتغطي مع كتلة الحضانة (الأجهزة الجزيئية) قبل تسخينها إلى درجة حرارة 42 درجة مئوية داخل الحاضنة.
- بعد حضانة لمدة 30 دقيقة ، أنابيب أجهزة الطرد المركزي التي تحتوي على مقتطفات في 800 (خ) ز لمدة 2 دقيقة. إغلاق الأنابيب وتخزين الخلايا في مقتطفات -80 حتى على استعداد لتنقية RNA درجة مئوية.
PAUSE POINT
- استخراج وتنقية العمود RNA وفقا لPicoPure (الأجهزة الجزيئية) تعليمات RNA عدة الاستخراج. الدناز العلاج هو اختياري ، ويمكن تنفيذها على عمود خلال تنقية الحمض النووي الريبي عند الضرورة. إذا لزم الأمر ، يمكن تجميع عينات LCM متعددة معا خلال تنقية في عمود واحد لزيادة الغلة RNA النهائي ويمكن eluted في حجم صغير (11-30 ميكرولتر) من شطف العازلة (PicoPure ، الأجهزة الجزيئية) وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. إذا رغبت في أن تكون قد استخدمت قسامة 1 ميكرولتر لتقييم جودة مجموع الحمض النووي الريبي على Bioanalyzer 2100 (اجيلنت تكنولوجيز ، وشركة).
ممثل النتائج
وقد استخدم ليزر microdissection التقاط (LCM) لعزل واحد ، فئة محددة أو متعددة الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة من اليرقات طور مرحلي الثالث (الشكل 1). LCM يسمح للحصول على درجة عالية من الدقة والتحديد في عزلة دا الخلية العصبية الهيئات ذبابة الفاكهة (الشكل 2A - C). وعلاوة على ذلك ، تم العثور على الحمض النووي الريبي مجموع تنقيته من هذه الخلايا العصبية دا معزولة ليكون من نوعية ممتازة كما أشارت إلى وجود 5.8S حادة ، و18S 28S الريباسي قمم RNA عند تحليلها على Bioanalyzer 2100 اجيلنت (اجيلنت تكنولوجيز ، وشركة) (الشكل 2D).
لتقييم تخصيب العصبية معينة من خلايا منعزلة لدينا أجرينا في الوقت الحقيقي عكس النسخ PCR الكمي (qRT - PCR) باستخدام جينات محددة العصبية علامة ، elav. لتحليل qRT - PCR ، قمنا بحساب المستويات النسبية للتعبير elav في LCM microdissected دا الخلايا العصبية وتطبيع هذا التعبير لأنه من سيطرتنا الذاتية (rp49) والحمض النووي الريبي النسبي لمجموع معزولة عن اليرقات كاملة باستخدام الأسلوب ΔΔCt 23. وكشفت هذه التحاليل أكثر من 2.5 أضعاف في تخصيب المستويات النسبية للelav LCM في الدقيقة دا تشريح عينات الخلايا العصبية بالمقارنة مع الحيوانات كلها (الشكل 3).
الشكل 1 : LCM من الخلايا العصبية الطرفية ذبابة الفاكهة. (أ) يتم تحديد السن المتطابقة اليرقات طور مرحلي الثالثة ، تغسل و (ب) جزءا لا يتجزأ من cryomold مع والمجمدة في أكتوبر -80 درجة مئوية ، (ج) يتم إنشاؤها 8μm أقسام الأنسجة التسلسلي باستخدام معيار ناظم البرد و (د) وضعت بشكل موحد على شرائح زجاجية نظيفة. يتم تخزين الشرائح الزجاجية مع أقسام الأنسجة الملصقة على -80 درجة مئوية قبل معالجة LCM (ه ، و) وعلى الفور LCM السابقة ، يتم إذابة الأنسجة وأبواب ثابتة لفترة وجيزة في الإيثانول بنسبة 70 ٪ تليها شطف وجيزة في DDH 2 O. (ز) المحتضنة لفترة وجيزة مع الشرائح التربسين وتشطف مع DDH 2 O لإزالة البشرة (أسود) من المقاطع اليرقات (ح ، ط) المقاطع نسيج بشرة دون مزيد من اليرقات ثم يتم التدرج في المجففة الايثانول وتطهيرها في النهاية الزيلين يتم وضع (ي) مع غطاء LCM بوليمر عطوب بالحرارة في قسم النسيج ونابض ليزر على جسم الخلية الفلورسنت المحدد. ونبضة ليزر يذوب البوليمر ويلف الجسم الخلية المحددة. رفع سقف البوليمر ، جنبا إلى جنب مع جسم الخلية القبض عليه ، و (ك)
الشكل 2 : LCM يسهل التقاط عالية الدقة من الخلايا العصبية دا. (أ) يعامل صورة الممثل من المجففة والتربسين الباب 8 الأنسجة ميكرون قبل LCM أداء ، والتي تبين two الدرجة الرابعة مع الخلايا العصبية المسماة دا GFP من PPK - GAL4 ، UASmCD8 : سلالة مراسل GFP. ملاحظة ، يتم تمييز واحدة من الخلايا العصبية (رأس السهم) لالتقاط (ب) خلايا الجسم من الخلايا العصبية وأبرزت (رأس السهم) هو نظيفة الدقيقة تشريح مع خصوصية عالية من قسم الأنسجة (ج) في نهاية العرض من فئة واحدة - IV دا عصبون القبض على الغطاء LCM (د) اجيلنت 2100 Bioanalyzer (اجيلنت تكنولوجيز ، وشركة) من الحمض النووي الريبي مجموع مخطط رحلاني معزولة عن الخلايا العصبية دا LCM المشتقة ، والتي تبين نوعية ممتازة RNA كما أشارت إلى وجود 5.8S حادة ، 18S والرنا الريباسي 28S القمم.
الشكل 3 : qRT - PCR يكشف عن تخصيب كبيرة من الخلايا العصبية علامة التعبير الجيني في الخلايا العصبية LCM القبض دا بالنسبة إلى كل الحيوانات القبض qRT - PCR تحليلات محددة عصبون علامة التعبير الجيني (elav) في LCM دا الخلايا العصبية (21 - 7 - GAL4 ، UAS - mCD8 : GFP) والحيوانات كلها في سن أنجز المتطابقة اليرقات طور مرحلي الثالث في ثلاث نسخ. تم تطبيع المستويات النسبية للتعبير دا LCM elav في الخلايا العصبية القبض على السيطرة الذاتية (rp49) وبالنسبة لليرقات بأكملها باستخدام الأسلوب ΔΔCt 23. القبض على لتخصيب 2.5 أضعاف في المستويات النسبية للelav في LCM وحظ دا عينات الخلايا العصبية بالنسبة للحيوانات كاملة.
المشاكل
المشكلة : رنا المتدهورة ، أو من نوعية متدنية.
شرط ضمان ريبونوكلياز مجانا طوال التجربة. حاول تقليل مقدار الوقت الذي يقضيه في LCM لكل شريحة لمدة 30 دقيقة. الحفاظ على الشرائح والعينات في الثلج الجاف إلا عند تنفيذ LCM. تجنب ذوبان المقاطع الأنسجة عندما يتم قطع.
المشكلة : يتم فقدان معظم الخلايا من الشريحة أثناء العلاج التربسين (الخطوة 17-18).
حاول تقليل وقت المعالجة التربسين. حاول تقليل تركيز التربسين.
المشكلة : وجود بشرة وغيرها من الحطام الأنسجة غير محددة على سقف البوليمر.
حاول إزالة الحطام الأنسجة التي النشاف سطح البوليمر مع الجانب مبتذل من مذكرة لاصقة 22.
المشكلة : انخفاض كفاءة LCM.
حاول زيادة فترة حضانة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ والزيلين. تقليل الرطوبة الغرفة باستخدام مزيلات الرطوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة توضح لنا طريقة الأمثل لعزل الخلايا العصبية الطرفية عن طريق ذبابة الفاكهة LCM. في حين تم تصميم هذا البروتوكول LCM للعزلة واحدة محددة ، والطبقة محددة أو متعددة الخلايا العصبية دا ذبابة الفاكهة من مرحلة اليرقات third طور مرحلي للتنمية ، يمكن بسهولة إدخال بعض التعديلات الطفيفة على البروتوكول يمكن تكييفها لإلقاء القبض على خلية ذبابة الفاكهة أنواع أخرى من جميع التنموية مراحل باستخدام GAL4 متميزة ، الجينات المحورة مراسل UAS - mCD8 - GFP التي تسمية نوع من الخلايا أو أنواع الفائدة. نتائجنا تدل على أن الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من الليزر التقاط الجزئي تشريح الخلايا العصبية دا هو من نوعية عالية جدا مما يسمح للاستخدام المباشر المحتملة في qRT - PCR أو تحليلات ميكروأري مقرا لها. تطبيقات هذا البروتوكول تتجاوز البرية القبض على خلايا من نوع من الاهتمام ، كما تمت مناقشته هنا ، حيث يمكن أن تستخدم في تركيبة LCM مع فقدان وظيفة ، من (UAS - رني) و / أو الحصول على وظيفة من بين الدراسات توظيف GAL4 / UAS النظام في نوع من الخلايا في المصالح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الدكاترة. Yuh - ننغ جان وGrueber ويس لتوفير مخزونات الطيران المستخدمة في هذه الدراسة ، وفرجينيا إسبينا ، والدكتور والدكتور ايمانويل Petricoin يوتا انس للحصول على مساعدة LCM. الكتاب يعترف F. توماس ميلر وكيت Jeffress الاستئماني التذكاري لدعم هذه البحوث (DNC) وجامعة جورج ماسون مكتب نائب مدير الجامعة ليالي (EPRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution |
| 2.5% Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| Xylenes, histological grade | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| RNAse-free water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
| Thin walled reaction tube with domed cap | Applied Biosystems | N8010611 | |
| ExtracSure Sample Extraction Device | Molecular Devices | LCM 0208 | |
| Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps | Molecular Devices | LCM0505 | |
| Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices | Molecular Devices | LCM0504 | |
| CapSure HS LCM caps | Molecular Devices | LCM0213 | |
| 75x100 mm glass slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Tissue embedding molds | Fisher Scientific | NC9642669 | |
| Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific, Inc. | 1415-5390 | |
| 70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol | |||
| Dry ice | |||
Equipment:
|
|||
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
- Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
- Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
- Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
- Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
- Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
- Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
- Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
- Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
- Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
- Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
- Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
- Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
- Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
- Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
