Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

Published: May 24, 2010 doi: 10.3791/2016
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Molecular and Microbiology, George Mason University, 2Krasnow Institute for Advanced Study, George Mason University

Summary

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או מרובים

Abstract

דנדריטים (דה) arborization נוירונים במערכת העצבים ההיקפית תסיסנית (PNS) לספק מערכת מודל מצוינת בה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס בכיתה ספציפית המורפוגנזה 1,2 דנדריט. כדי להקל על ניתוח מולקולרי של מחלקה ספציפית דה נוירון פיתוח, חיוני להשיג תאים אלה באוכלוסייה טהור. למרות מגוון רחב של תאים שונים, ספציפיים רקמות טכניקות בידוד RNA קיימים תאים תסיסנית, כולל טיהור תא חרוז מגנטי מבוסס 3,4, תא פלורסנט מיון פעיל (FACS) 5-8, ו - RNA חלבון מחייב מבוסס אסטרטגיות 9, אף אחד שיטות אלה יכול להיות מנוצל בקלות לבידוד בודדות או מרובות בכיתה ספציפית תסיסנית נוירונים דה עם רמה גבוהה של דיוק מרחבית. Microdissection לייזר לכידת (LCM) התפתחה ככלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי לבודד את סוגי תאים מסוימים ממקטעים רקמה עם רמה גבוהה של דיוק ברזולוציה מרחבית. RNA בתאים מבודדים המתקבל לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוחים כולל qRT-PCR ו פרופיל microarray ביטוי בתוך סוג תא נתון 10-16. עד כה, LCM לא הוחל נרחב בניתוח של רקמות ותאים תסיסנית 17,18, כולל נוירונים דה בשלב instar third הזחל של התפתחות.

כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה שלנו הבידוד של נוירונים תסיסנית דה באמצעות מעמד אינפרא אדום (IR) של LCM. שיטה זו מאפשרת ללכוד של, נוירונים בודדים דה בכיתה ספציפית או מספר עם סגוליות גבוהה ברזולוציה מרחבית. גיל בהתאמה third הזחלים instar להביע כטב"מ-mCD8: 19-GFP transgene בשליטת גם את הרביעי בכיתה דה נוירון ספציפי פ.פ.ק.-20 GAL4 הנהג או פאן דה נוירון ספציפי 21-7 21-GAL4 הנהג שימשו אלה ניסויים. RNA המתקבלים נוירונים בודדים דה הוא באיכות גבוהה מאוד וניתן להשתמש בו ישירות ליישומים במורד הזרם, כולל qRT-PCR או microarray מנתח. יתר על כן, פרוטוקול זה LCM ניתן להתאים בקלות ללכוד סוגים אחרים תסיסנית תא בשלבים שונים של פיתוח תלויים בסוג תא מסוים, GAL4 מונחה דפוס הביטוי של ה-GFP.

Protocol

הערות כלליות על LCM של תסיסנית היקפיים נוירונים

אפשר מ 6 שעות, עד שבוע או יותר עבור LCM בהתאם לסוג רקמה את מספר התאים הדרושים.

כל ההליכים מתבצעים אך ורק RNAse ללא התנאים הבאים נהלים סטנדרטיים. הזחלים להביע או 21-7-GAL4, כטב"מ-mCD8: GFP או פ.פ.ק.-GAL4, כטב"מ-mCD8: GFP קווי מהונדס הכתב ששימשו בניסויים אלו.

1. הכנת הזחלים

  1. איסוף 30-40 גיל בהתאמה third הזחלים instar ולשטוף אותם DDH 2 O ואחריו שטיפות קצרה RNAse חוץ (סיגמא אולדריץ '), וכן לשטוף הסופי DDH 2 O להסיר RNAse Away. וויק את עודף DDH 2 O לחלוטין עם Kimwipe נקי לפני הטבעה הזחלים ב אוקטובר
  2. קחו רקמות נקייה הטבעה עובש שכבה עם שכבה (1.5-2mm) דקה של אוקטובר, בדיוק מספיק כדי לכסות שכבה יחידה של הזחלים.
  3. לפני הטמעת הזחלים, אם יש צורך, לקרר את אוקטובר עד 0 ° C של תבניות הטבעה רקמות. לעשות זאת על ידי הצבת את התבנית המכילה אוקטובר על גוש קרח. זה יעזור להפחית את תנועת הזחל במהלך תהליך ההטמעה.
  4. מניחים את הזחלים נקי על טרום מקורר אוקטובר ומסדרים אותם במקביל אחד לשני. לאחר הזחלים כבר מסודרים, לאט למלא את התבנית עם אוקטובר מבלי להפריע את הסדר הזחל. הצמד להקפיא את התבנית ידי הצבתו על גוש קרח יבש. [שלב קריטי:. Snap-להקפיא את הזחלים מיידית כדי להפחית את התנועה] שיטה זו תאפשר הזחלים להיות במישור אחד, למקסם את מספר התאים הזמינים לכל סעיף ללכוד.

אם יש צורך לשמר את המורפולוגיה רקמות לזיהוי תאים של עניין, או אם המספר הצפוי של תאים לכל סעיף נמצא להיות משביע רצון אז להמשיך ישירות אל שלב 11.

לחילופין אם התאים המוגדרים מפורשות ויכול להיות מזוהה עם סמן לזיהוי בקלות כגון GFP או RFP, אבל את מספר התאים לכל סעיף נמצא להיות נמוך, אז שלבים 05-10 מאי להיות מועיל עבור הגדלת מספר התאים הזמינים עבור לכידת לכל סעיף. אלה הם צעדים אופציונליים צריך להישקל רק אם נדרש, כשיטה להגדיל את מספר הנוירונים דה זמין LCM לכל קטע כאשר כל שיטה אחרת אינה מצליחה לספק תוצאות חיוביות. [זהירות: שיטה זו עשויה לשבש את רקמת מורפולוגיה הכוללת ולעשות זיהוי רקמות המבוססת על המיקום המרחבי ספציפי קשה מאוד.]

  1. לשטוף 50-70 third הזחלים instar כפי שמתואר בשלב 1. מניחים את הזחלים בתוך שפופרת מ"ל 1.5 microfuge המכיל 500 μl של RNAse חינם 1X PBS.
  2. Dounce הזחלים באמצעות העלי פוליפרופילן (ארה"ב מדעי), עם 6-7 משיכות עוצמה איטי.
  3. צנטריפוגה הפתרון על 16,000 (x) g עבור 5-10 שניות (עד שורשה הזחל להתיישב אל החלק התחתון של הצינור microfuge]. מחק supernatant. גלולה צריך בעיקר מורכב לציפורן הזחל שאליו PNS, כולל נוירונים da , הוא דבק חזק.
  4. שטפו את לציפורן גלולה 2-3 פעמים 1X PBS ו resuspend גלולה ב 500 μl 1X PBS. ספין הפתרון על 16,000 (x) g דקה 1 כדי ליצור גלולה קומפקטי. לשאוב supernatant לחלוטין באמצעות קנס פיפטה פסטר.
  5. הסר בזהירות את גלולה מהצינור microfuge בעזרת מרית נקייה, הפתיל את PBS עודף באמצעות רקמות Kimwipe נקי. [הערה: חשוב לשמור על גלולה כמו קומפקטי ככל האפשר כדי להגדיל את התשואה תא]. מניחים את קומפקטית לציפורן גלולה על תבנית פלסטיק המכילה שכבה דקה של אוקטובר (כ 1 מ"מ).
  6. התפשטות בעדינות באזור מעגלי דק את גלולה. ממלאים את התבנית עם אוקטובר, ולהקפיא את הרקמה כפי שמתואר בשלב 4.
  7. שימוש cryostat, לחתוך חלקים קפואים על עובי 5-8 מיקרומטר במישור, שכותרתו, טעונים, RNAse שקופיות מיקרוסקופ חינם זכוכית. [שלב קריטי: מקם את הסעיפים רקמות בסמוך למרכז השקופית.]
  8. אחסן את השקופיות באופן ישיר על קרח יבש או -80 מעלות צלזיוס נקי להחליק-box עד מוכן microdissection. בצע LCM רצוי בתוך שבוע לאחר חתך את הרקמה.

PAUSE POINT

2. הסרת התייבשות לציפורן מ מדורים הזחל קפוא

[שלב קריטי: כל פתרונות התייבשות חייב להיות מוכן טרי לפני כל פגישה LCM. התייבשות מוחלטת של חלקים קפואים הזחל רקמה חיונית להשגת יעילות microdissection optimal]

  1. הסר את השקופיות המכילות את הסעיפים קפוא רקמות הזחל מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס ומניחים אותם על קרח יבש.
  2. הסר שקופית אחת מתוך קרח יבש ומיד למקם אותו ישירותלתוך צינור חרוטי 50 מ"ל מלא מקבע אתנול 70%, ואחריה לשטוף קצר ב RNAse חינם DDH 2 O פי פעמים מומלץ מוצגים בלוח 1.
  3. הנוכחות של לציפורן הזחל בסעיפים קפוא עשוי לפגום ביעילות ללכוד ידי מניעת LCM יעיל כובע תאים קשר אשר עלול להוביל ללכידת הלא ספציפית. אם יש צורך, לבצע את הפעולות הבאות (4-5) כדי לנקות את לציפורן ממקטעים רקמות.
  4. בעדינות פיפטה 50 μl של טריפסין 2.5% ישירות על גבי החלקים רקמות דגירה של 5-30 שניות בטמפרטורת החדר. [שלב קריטי: צעד זה עשוי לדרוש אופטימיזציה. זמן הדגירה תלוי הרקמה להיות microdissected ועובי סעיף. הדגירה ארוך יותר עשויה ברור הכל כולל תאים של עניין, בעוד הדגירה הקצר עשוי להיות מספיק כדי להסיר את העור המת]
  5. יש לשטוף את החלקים בקצרה צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל RNAse ללא DDH 2 O להסיר טריפסין, ושברי לציפורן דבק רופף.
  6. טובלים את השקופיות ברצף בכל אחד של אתנול הנותרים ופתרונות קסילן על פי המומלץ (טבלה 1) כדי להשלים את תהליך התייבשות.
  7. בעקבות השיפוע התייבשות, מגלשות הם מיובשים בקצרה על 60-120 שניות תחת זרם אוויר עדין בטמפרטורת החדר לפני ביצוע LCM. [זהירות: יבש קסילן לחלוטין את הסעיפים הרקמה לפני ביצוע LCM. קסילן ידוע לפזר את כובע LCM פולימר לכשל microdissection].
אתנול 70% (מיצב) 3-10 שניות
DDH 2 O 5-10 שניות
טריפסין 2.5% דגירה 5-30 שניות
DDH 2 O 5-10 שניות
70% אתנול 60 שניות
95% אתנול 60 שניות
100% אתנול 120 שניות
100% אתנול 120 שניות
100% קסילן 120 שניות
100% קסילן 120 שניות
האוויר יבש בזרם אוויר קל 60-120 שניות

טבלה 1: נוהל מומלץ LCM התייבשות של חלקים קפואים רקמות הזחל.

3. לייזר Microdissection לכידת

PixCell IIE מכשיר LCM מצויד פלואוריד 300 אופטיקה epifluorescence אופטימיזציה עבור EGFP שימש ביצוע LCM.

[שלב קריטי: אם אפשר, לבצע את microdissection בחדר לחות מבוקרת כדי למנוע ירידה ביעילות microdissection בשל לחות מוגברת. לחות בחדר היא גורם מכריע המשפיע על יעילות microdissection. לחות נמוכה בחדר יכולה לגרום לעלייה סטטי נאחזים וכתוצאה מכך ללכוד הלא ספציפית, בעוד הלחות בחדר גבוה יכול לגרום microdissection יעילות נמוכה. השגנו יעילות LCM אופטימלי בין 25-50% לחות יחסית לתנאים.]

  1. הפעילו את המחשב עבור המיקרוסקופ ושליטה תיבת לייזר.
  2. טען את כובע CapSure הרכבה מחזיק עם HS LCM כמוסות (התקנים מולקולריים): שתי מחסניות של כמוסות LCM יוטענו בבת אחת.
  3. פתח את תוכנת התקנים מולקולריים ולהזין את פרטי הניסוי כולל מספר שקופיות הרבה מספר שווי.
  4. טען כובע חדש HS LCM מהמחסנית אל מכשיר IIE LCM PixCell ומקם אותה כראוי לגבי הג'ויסטיק כדי להבטיח מיקום נכון של המכסה ביחס לאזור הלכידה.
  5. מניחים את השקופית מיקרוסקופ המכיל מיובש טרי סעיפים רקמות הזחל על הבמה מיקרוסקופ עבור microdissection.
  6. אתר את התאים שכותרתו fluorescently באמצעות oculars או מסך המחשב. בשל סגוליות גבוהה של פ.פ.ק.-GAL4, כטב"מ-mCD8: GFP קו מהונדס הכתב, הרביעי המעמד נוירונים דה ניתן לזהות בקלות על ידי ה-GFP פלואורסצנטי.
  7. נושא הרקמה כדי LCM באמצעות CapSure HS LCM כמוסות [עבור קבוצה מפורטת של הוראות להגדרת המכשיר, תוך התמקדות הלייזר וביצוע LCM לראות התייחסות 22].
  8. התאם את "כוח" ו "משך" לייזר פרמטרים הדופק כדי להשיג נקודה מדויקת הפולימר נמס, אשר גודל מתאים את גודל לייזר שנבחר במקום. התאם את ההגדרות כדי להתאים את גודל השטח הפולימר נמס. הפרמטרים הבאים שימשו microdissecting יחיד בכיתה ד דה נוירונים: קוטר Spot 7.5 מיקרומטר, כוח לייזר 30-50 mW, זמן לייזר ו 2-4 ו 1-2 ms sנדלקת בכל תא היו בשימוש. [שלב קריטי: לייזר הפרמטרים הנדרשים במקום הנכון עשוי להשתנות עם עובי רקמת ולחות התנאים בחדר. התאם את "כוח" הגדרות "משך" כדי להשיג את הגודל הנדרש נמס פולימר נקודה עבור microdissecting תאים בודדים או מרובים.]
  9. כדי למקסם את סגוליות, microdissect תאים עם חפיפה מינימלית הקרינה חזקה. כל כובע הוא מסוגל ללכוד גופי התא רבים. [שלב קריטי: כדי למנוע השפלה RNA, להגביל את זמן הניתוח סך כולל התייבשות microdissection פחות מ 45 דקות]
  10. לאחר כל התאים עניין נתפסו, להרים את LCM HS כובע עם התאים microdissected והניח אותה על שקופית נקי כדי לאשר את נוכחותם של תאים בשבי ויזואלית לבדוק את הכובע על נוכחות של תאים לא רצויים או פסולת.

4. בידוד RNA מן התאים שמקורם LCM

  1. צרף את הכובע המכיל את התאים microdissected למכשיר (התקנים מולקולריים) ExtracSure. הוסף 12μl של רנ"א מיצוי חיץ (PicoPure, התקנים מולקולריים) על פני השטח מכסה המכיל את התאים לחבר צינור דק דופן הפוך תגובה (GeneAmp, Applied Biosystems) למכשיר ExtracSure. מניחים את הרכבה על מגש יישור (התקנים מולקולריים) ולכסות אותו עם לחסום הדגירה (התקנים מולקולריים) מחומם מראש ל 42 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור.
  2. לאחר דגירה של 30 דקות, צנטריפוגה צינורות המכיל את תמציות 800 (x) g במשך 2 דקות. סגור את צינורות בחנות תמציות התא ב -80 ° C עד מוכנים לטיהור RNA.

PAUSE POINT

  1. תמצית ועמודה לטהר את RNA לפי PicoPure (התקנים מולקולריים) ערכה הוראות RNA החילוץ. טיפול DNAse הוא אופציונלי, וניתן לבצעו על עמודה במהלך טיהור RNA לפי הצורך. במידת הצורך, דגימות LCM מרובות ניתן אספו במהלך טיהור בעמודה בודדת כדי להגדיל את התשואה הסופית RNA וניתן eluted בנפח קטן (11-30 μl) של חיץ elution (PicoPure, התקנים מולקולריים) ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. אם תרצה aliquot 1 μl ניתן להשתמש כדי להעריך את האיכות הכוללת RNA על Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc).

נציג תוצאות

Microdissection לייזר ללכוד (LCM) שימש לבודד אחת, בכיתה ספציפית או מספר תסיסנית נוירונים דה מן הזחלים instar השלישי (איור 1). LCM מאפשר רמה גבוהה של דיוק סגוליות בבידוד של תסיסנית גופים דה נוירון תא (איור 2 א, ג). יתר על כן, RNA הכולל מטוהרים אלו נוירונים בודדים דה נמצאה להיות באיכות מעולה כפי שצוין על ידי נוכחות של 5.8S, 18S חדה -28 פסגות RNA ריבוזומלי כאשר נותחו על 2100 Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) (איור 2d).

כדי להעריך את העשרת עצבי ספציפי של תאים מבודדים שלנו ערכנו בזמן אמת כמותי שעתוק לאחור PCR (qRT-PCR) באמצעות גן ספציפי העצבית סמן, elav. עבור qRT-PCR מנתח, חישבנו את רמות היחסי של הביטוי elav ב LCM microdissected נוירונים דה וביטוי מנורמל זה כי השליטה שלנו אנדוגני (rp49) ויחסית RNA שבודד סך כל הזחלים בשיטת ΔΔCt 23. ניתוחים אלה נחשפו על העשרת 2.5 לקפל את רמות היחסי של elav ב LCM מיקרו גזור דה דגימות נוירון בהשוואה חיות שלם (איור 3).

איור 1
איור 1: LCM של נוירונים תסיסנית היקפי. (א) בהתאמה הגיל השלישי הזחלים instar נבחרים, שטופים (ב) מוטבע cryomold עם אוקטובר קפואים ב -80 ° C, (ג) 8μm סעיפים רקמות סדרתי נוצרות באמצעות cryostat סטנדרטיים (ד) להציב באופן אחיד על שקופיות הזכוכית נקייה. שקופיות הזכוכית עם בסעיפים רקמה מודבקת מאוחסנים ב -80 ° C לפני LCM עיבוד. (ה, ו) שקדמה LCM, בסעיפים רקמה מופשר קבוע בקצרה אתנול 70% ואחריה לשטוף קצר DDH 2 O. (ז) השקופיות מודגרת בקצרה עם טריפסין ושטף עם DDH 2 O להסיר את העור הקרני (שחור) מן החלקים הזחל. (ח, ט) סעיפים רקמות ללא לציפורן הזחל ואז הם מיובש נוספת שיפוע אתנול פינתה סוף סוף קסילן . (י) כובע LCM עם פולימר thermolabile מושם על הקטע רקמות הלייזר פעמו על גוף התא הנבחר ניאון. הדופק לייזר ממיס את הפולימר בולעת את גוף התא הנבחר. כובע הפולימר, יחד עם גוף התא הוא הרים כבשו, ו (יא)

איור 2
איור 2: LCM מאפשרת ללכוד דיוק גבוהה של נוירונים דה. (א) התמונה נציג מיובש טריפסין טיפול רקמות סעיף 8 מיקרון לפני LCM מבצע, מראה שתי בכיתה-IV נוירונים דה שכותרתו עם GFP ידי פ.פ.ק.-GAL4, UASmCD8: זן GFP הכתב. שים לב, אחד של נוירונים מסומן (ראש חץ) עבור לכידת. (ב) גוף התא של הנוירון מודגשות (ראש חץ) הוא נקי מיקרו גזור עם סגוליות גבוהה מהחלק רקמות. (ג) על קצה להציג מעמד יחיד IV-da נוירון שנתפסו על כובע LCM. (ד) Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) electropherogram של רנ"א סך מבודד LCM-derived נוירונים דה, מראה באיכות מעולה RNA כמצוין על ידי נוכחות של 5.8S, 18S חדה , ו -28 rRNA פסגות.

איור 3
איור 3:. QRT-PCR מגלה העשרה משמעותית של ביטוי גנים העצבית סמן LCM שנתפסו נוירונים דה ביחס חיים שלמים qRT-PCR מנתח הביטוי נוירון ספציפי סמן גנטי (elav) ב LCM כבשו דה נוירונים (21-7-GAL4, כטב"מ-mCD8: GFP) ובעלי חיים שלמים גיל מתאימים third הזחלים instar בוצעה בשלושה עותקים. רמות יחסית הביטוי elav ב LCM כבשו דה נוירונים היו מנורמל לשלוט אנדוגני (rp49) ויחסית הזחלים כולו בשיטת ΔΔCt 23. העשרה 2.5 לקפל את רמות היחסי של elav ב LCM כבשו דה דגימות נוירון נצפתה ביחס חיות שלם.

פתרון בעיות

בעיה: RNA מושפל, או באיכות נמוכה.

ודא מצב RNAse חינם בכל ניסוי. נסה להקטין כמות הזמן המושקע על LCM לכל שקופית 30 דקות. שמור את שקופיות על דגימות קרח יבש, למעט בעת ביצוע LCM. הימנע הפשרה בסעיפים רקמה ברגע שהם נחתכים.

בעיה: רוב התאים הם איבדו משקופית במהלך הטיפול טריפסין (שלב 17-18).

נסה לצמצם את זמן הטיפול טריפסין. נסה לצמצם את ריכוז טריפסין.

בעיה: נוכחות של לציפורן ופסולת אחרת הלא ספציפית רקמה על כובע פולימר.

נסה להסיר את הלכלוך על ידי רקמה סופג את פני השטח פולימר עם הצד של פתק דביק דבק 22.

בעיה: LCM יעילות נמוכה.

נסה להגדיל את זמן הדגירה של אתנול xylenes 100%. הפחתת הלחות בחדר באמצעות dehumidifiers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול המוצגת כאן מתארת ​​את שיטת אופטימיזציה שלנו הבידוד של נוירונים תסיסנית הפריפריה באמצעות LCM. אמנם זה פרוטוקול LCM תוכנן עבור בידוד הספציפי של יחיד, מחלקה ספציפית או מספר הנוירונים תסיסנית דה משלב instar third הזחל של פיתוח, שינויים קלים של פרוטוקול יכול בקלות להיות מותאמים עבור לכידתו של סוגים אחרים תסיסנית תא מכל התפתחותי בשלבים באמצעות GAL4 ברורים, כטב"מ-mCD8-GFP transgenes הכתב אשר התווית את סוג התא או סוגים של עניין. התוצאות שלנו מראות כי RNA המתקבל ללכוד לייזר מיקרו גזור דה נוירונים הוא באיכות גבוהה מאוד המאפשר שימוש ישיר פוטנציאליים qRT-PCR או microarray המבוסס על ניתוח. יישומים של פרוטוקול זה להרחיב מעבר לכידתו של wild-type תאים של עניין, כפי שנדונו כאן, שם LCM יכול לשמש בשילוב עם אובדן פונקציה של (כטב"מ-RNAi) ו / או לקבל-of-פונקציה מחקרים העסקת GAL4 / כטב"מ מערכת בסוג התא של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה, ווירג'יניה Espina, ד"ר עמנואל Petricoin ד"ר לאנס ליוטה לסיוע עם LCM. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ואת אוניברסיטת ג'ורג' מייסון מכללה משרד s (EPRI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) MP Biomedicals PBS10X02 Diluted to 1X working solution
2.5% Trypsin Sigma-Aldrich T1426
RNase-AWAY Sigma-Aldrich 83931
Xylenes, histological grade Fisher Scientific X3S-4
RNAse-free water Fisher Scientific BP561-1
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound Tissue-Tek 4583
PicoPure RNA Isolation Kit Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions
Thin walled reaction tube with domed cap Applied Biosystems N8010611
ExtracSure Sample Extraction Device Molecular Devices LCM 0208
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps Molecular Devices LCM0505
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices Molecular Devices LCM0504
CapSure HS LCM caps Molecular Devices LCM0213
75x100 mm glass slides Fisher Scientific 12-544-3
Tissue embedding molds Fisher Scientific NC9642669
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes USA Scientific, Inc. 1415-5390
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol
Dry ice

Equipment:

  • Cryostat
  • 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
  • -80°C freezer
  • Incubator
  • PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  2. Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
  3. Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
  4. Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
  5. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
  6. Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
  7. Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
  8. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  9. Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
  10. Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
  11. Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
  12. Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
  13. Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
  14. Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  15. Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
  16. Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
  17. Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
  18. Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
  19. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  20. Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  21. Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
  22. Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).

Tags

יופיטר Neuroscience גיליון 39 תסיסנית נוירון מערכת העצבים ההיקפית (PNS) נוירונים arborization הדנדריטים RNA microarray qRT-PCR בידוד תא Microdissection לייזר לכידת (LCM)
לייזר Microdissection לכידה של<em> תסיסנית</em> נוירונים היקפיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser… More

Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter