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Neuroscience

लेजर कैद की Microdissection ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स

doi: 10.3791/2016 Published: May 24, 2010

Summary

इस वीडियो लेख में हम अलग - थलग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत एकल या एकाधिक

Protocol

ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स के LCM पर जनरल टिप्पणियाँ

6 घंटे से अनुमति दें, एक सप्ताह या LCM के लिए अब ऊतक प्रकार और आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के आधार पर.

सभी प्रक्रियाओं बाहर सख्ती से RNase मुक्त परिस्थितियों में मानक प्रक्रियाओं का पालन किया जाता है. या तो 21-7 GAL4 व्यक्त लार्वा, यूएएस mCD8: GFP या ppk - GAL4, यूएएस mCD8: GFP ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया.

1. लार्वा तैयारी

  1. 30-40 उम्र से मिलान तीसरे instar लार्वा लीजिए और उन्हें DDH 2 हे धो RNase दूर (सिग्मा Aldrich) में संक्षिप्त rinses, और DDH 2 हे में एक अंतिम धोने RNase दूर हटायें द्वारा पीछा किया. अक्टूबर में लार्वा embedding के लिए एक साफ पहले Kimwipe के साथ पूरी तरह से अतिरिक्त DDH 2 हे बाती.
  2. अक्टूबर (1.5-2mm) की एक पतली परत के साथ एक साफ ऊतक एम्बेडिंग मोल्ड और यह परत ले लो, बस लार्वा की एक एक परत को कवर पर्याप्त है.
  3. लार्वा एम्बेड करने से पहले, अगर जरूरत है, 0 डिग्री सेल्सियस ऊतक एम्बेडिंग molds में अक्टूबर शांत. बर्फ का एक ब्लॉक पर अक्टूबर युक्त मोल्ड रखकर यह मत करो. यह एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान लार्वा आंदोलन को कम करने में मदद करेगा.
  4. पूर्व ठंडा अक्टूबर पर साफ लार्वा प्लेस और उन्हें एक दूसरे के समानांतर में व्यवस्था. एक बार लार्वा व्यवस्थित किया गया है, धीरे धीरे अक्टूबर साथ लार्वा व्यवस्था परेशान बिना मोल्ड भरने. यह एक सूखी बर्फ ब्लॉक पर रखकर ढालना फ्रीज स्नैप. [महत्वपूर्ण कदम:] स्नैप - फ्रीज तुरन्त लार्वा आंदोलन को कम करने के लिए इस विधि एक ही विमान में लार्वा होने के लिए प्रति कब्जा करने के लिए अनुभाग उपलब्ध कक्षों की संख्या को अधिकतम अनुमति देगा.

यदि यह आवश्यक है कि ब्याज की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए ऊतक आकारिकी की रक्षा के लिए, या यदि अनुभाग प्रति कोशिकाओं की उम्मीद की संख्या तो सीधे आगे बढ़ने के लिए चरण 11 संतोषजनक पाया जाता है.

वैकल्पिक रूप से अगर कोशिकाओं विशेष रूप से चिह्नित कर रहे हैं और जैसे GFP या आरएफपी एक को आसानी से पहचाना मार्कर के साथ पहचाना जा सकता है है, लेकिन अनुभाग प्रति कोशिकाओं की संख्या कम हो पाया है, तो 50-10 कदम उपलब्ध कक्षों की संख्या को बढ़ाने के लिए सहायक हो सकता है है अनुभाग प्रति कब्जा करने के लिए. ये वैकल्पिक कदम उठाए हैं और किया जाना चाहिए सिर्फ अगर आवश्यक दा अनुभाग प्रति LCM के लिए उपलब्ध न्यूरॉन्स की संख्या बढ़ रही है जब अन्य विधि के लिए अनुकूल परिणाम उपलब्ध कराने में विफल रहता है के लिए एक विधि के रूप में माना जाता है. [चेतावनी: इस विधि समग्र ऊतक आकारिकी को बाधित और ऊतक विशिष्ट स्थानिक स्थान के आधार पर बहुत मुश्किल पहचान बना सकता है. ]

  1. 50-70 तीसरे instar लार्वा के रूप में चरण 1 में वर्णित धो लें. 1.5 मिलीलीटर microfuge RNase मुक्त 1X पीबीएस के 500 μl युक्त ट्यूब में लार्वा प्लेस.
  2. एक polypropylene मूसल (संयुक्त राज्य अमेरिका वैज्ञानिक), 6-7 धीमी शक्तिशाली स्ट्रोक के साथ, का उपयोग लार्वा Dounce.
  3. +१६००० पर समाधान अपकेंद्रित्र (एक्स) जी (तक लार्वा cuticles microfuge ट्यूब के नीचे बसने] सतह पर तैरनेवाला त्यागें. गोली मुख्य रूप से लार्वा छल्ली से मिलकर चाहिए के 5-10 सेकंड के लिए जो दा न्यूरॉन्स सहित पीएन , कस पालन किया है.
  4. 1X पीबीएस और 500 μl 1X पीबीएस में resuspend गोली में छल्ली गोली 2-3 बार धोएं. सोलह हज़ार (एक्स) 1 मिनट के लिए एक कॉम्पैक्ट गोली फार्म के लिए छ समाधान स्पिन. पूरी तरह से ठीक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
  5. ध्यान से microfuge ट्यूब से एक साफ रंग का उपयोग कर गोली निकालने के लिए, और से अतिरिक्त एक स्वच्छ Kimwipe ऊतक का उपयोग पीबीएस बाती. [ध्यान दें: यह महत्वपूर्ण है के रूप में संभव के रूप में कॉम्पैक्ट गोली रखने के लिए सेल उपज बढ़ाने ]. एक प्लास्टिक मोल्ड पर अक्टूबर (1mm लगभग) की एक पतली परत युक्त कॉम्पैक्ट छल्ली गोली रखें.
  6. धीरे से एक पतली परिपत्र क्षेत्र में गोली बाहर फैला. अक्टूबर साथ मोल्ड भरें, और ऊतक फ्रीज चरण 4 में वर्णित के रूप में.
  7. एक cryostat का प्रयोग, सादे, लेबल, uncharged, RNase मुक्त गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर 5-8 सुक्ष्ममापी मोटाई पर जमे हुए वर्गों में कटौती. [महत्वपूर्ण कदम: स्लाइड के केंद्र के पास ऊतक वर्गों स्थिति.]
  8. या तो सूखी बर्फ पर सीधे या -80 डिग्री सेल्सियस microdissection के लिए तैयार है जब तक एक साफ स्लाइड बॉक्स में स्लाइड्स स्टोर. ऊतक सेक्शनिंग के बाद एक सप्ताह के भीतर बेहतर LCM प्रदर्शन.

रोकें सूत्री

2. जमे हुए लारवल धारा से निर्जलीकरण और छल्ली हटाना

[महत्वपूर्ण कदम: निर्जलीकरण के लिए सभी समाधान प्रत्येक LCM सत्र से पहले ताजा तैयार होना चाहिए. जमी लार्वा ऊतक वर्गों की पूरी निर्जलीकरण इष्टतम microdissection दक्षता प्राप्त करने के के लिए आवश्यक है]

  1. -80 ° सी फ्रीजर से जमे हुए लार्वा ऊतक वर्गों से युक्त स्लाइड्स निकालें और उन्हें सूखी बर्फ पर जगह है.
  2. सूखी बर्फ से एक एकल स्लाइड निकालें और तुरंत यह सीधे जगहएक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार 70% इथेनॉल लगानेवाला, कम सिफारिश की तालिका 1 में प्रस्तुत समय के अनुसार RNase मुक्त DDH 2 हे में कुल्ला द्वारा पीछा के साथ भरा ट्यूब में .
  3. जमे हुए वर्गों में लार्वा छल्ली की उपस्थिति कुशल LCM संपर्क टोपी सेल जो गैर विशिष्ट कब्जा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं रोकने के द्वारा कब्जा क्षमता क्षीण कर सकते हैं. यदि आवश्यक हो, निम्न चरणों (4-5) का संचालन करने के लिए ऊतक वर्गों से छल्ली स्पष्ट.
  4. धीरे 2.5% trypsin के 50 μl सीधे ऊतक वर्गों पर विंदुक और कमरे के तापमान पर 5-30 सेकंड के लिए सेते हैं. [महत्वपूर्ण कदम: इस कदम अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. ऊष्मायन समय microdissected हो ऊतक और अनुभाग मोटाई पर निर्भर करता है है. अब ऊष्मायन ब्याज की कोशिकाओं सहित सब कुछ स्पष्ट है, जबकि एक छोटी ऊष्मायन अपर्याप्त छल्ली निकाल सकते हो सकता है]
  5. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार RNase मुक्त DDH 2 हे युक्त trypsin निकालने के लिए, और शिथिल पालन छल्ली टुकड़े ट्यूब में अनुभागों को संक्षिप्त कुल्ला .
  6. स्लाइड्स sequentially शेष इथेनॉल और सिफारिश बार (तालिका 1) के लिए xylene समाधान के प्रत्येक में निर्जलीकरण प्रक्रिया को पूरा करने के लिए डुबकी.
  7. निर्जलीकरण ढाल के बाद, स्लाइड संक्षेप में 60-120 सेकंड के लिए एक हल्के हवा धारा के तहत कमरे में LCM का प्रदर्शन करने से पहले तापमान पर सूख. [चेतावनी: xylene LCM का प्रदर्शन करने से पहले ऊतक वर्गों से पूरी तरह से सूखी . Xylene LCM टोपी microdissection विफलता में जिसके परिणामस्वरूप बहुलक] को भंग करने के लिए जाना जाता है.
70% इथेनॉल (लगानेवाला) 3-10 सेकंड
DDH 2 हे 5-10 सेकंड
2.5% trypsin ऊष्मायन 5-30 सेकंड
DDH 2 हे 5-10 सेकंड
70% इथेनॉल 60 सेकंड्स
95% इथेनॉल 60 सेकंड्स
100% इथेनॉल 120 सेकंड
100% इथेनॉल 120 सेकंड
100% Xylene 120 सेकंड
100% Xylene 120 सेकंड
एक हल्के हवा धारा में एयर शुष्क 60-120 सेकंड

तालिका 1: जमी लार्वा ऊतक वर्गों के LCM निर्जलीकरण के लिए अनुशंसित प्रक्रिया .

3. लेजर कैद Microdissection

PixCell आईआईई LCM Fluor 300 epifluorescence EGFP के लिए अनुकूलित प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित साधन LCM का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.

[महत्वपूर्ण कदम: यदि संभव हो तो, microdissection दक्षता में किसी भी वृद्धि हुई नमी के कारण कमी को रोकने के लिए एक नमी नियंत्रित करने के लिए कमरे में microdissection प्रदर्शन. कक्ष नमी एक महत्वपूर्ण microdissection दक्षता प्रभावित कारक है. कम कमरा नमी पैदा कर सकता है एक वृद्धि गैर विशिष्ट कब्जा में जिसके परिणामस्वरूप स्थैतिक चिपटना, जबकि उच्च कमरा नमी कम microdissection दक्षता में परिणाम कर सकते हैं. हम 25-50% सापेक्ष आर्द्रता की स्थिति के बीच इष्टतम LCM दक्षता हासिल की.]

  1. खुर्दबीन और लेजर नियंत्रण बॉक्स के लिए सत्ता पर मुड़ें.
  2. LCM टोपी के दो कारतूस एक समय में लोड किया जा सकता है: एच एस LCM टोपियां (आण्विक डिवाइसेज) के साथ CapSure टोपी धारक विधानसभा लोड.
  3. आण्विक डिवाइसेज सॉफ्टवेयर खोलें और प्रयोग स्लाइड संख्या और कैप बहुत संख्या सहित विवरण दर्ज करें.
  4. PixCell आईआईई LCM साधन और जोस्टिक के लिए सम्मान के साथ इसे सही ढंग से स्थिति पर कारतूस से एक नया एच एस LCM टोपी लोड कब्जा क्षेत्र के लिए टोपी के संबंध में उचित स्थिति सुनिश्चित करने के लिए.
  5. खुर्दबीन स्लाइड युक्त हौसले निर्जलित microdissection के लिए खुर्दबीन मंच पर लार्वा ऊतक वर्गों रखें.
  6. Fluorescently लेबल oculars या कंप्यूटर स्क्रीन का उपयोग कोशिकाओं का पता लगाएँ. : Ppk GAL4, यूएएस - mCD8 के उच्च विशिष्टता के कारण: GFP ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइन, चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स GFP प्रतिदीप्ति द्वारा आसानी से पहचान किया जा सकता है .
  7. विषय CapSure एचएस LCM टोपियां का उपयोग LCM ऊतक [साधन स्थापना, लेजर ध्यान केंद्रित है और प्रदर्शन LCM के लिए निर्देशों का एक विस्तृत सेट के लिए 22 संदर्भ देखें ].
  8. "पावर" और "अवधि" लेजर पल्स पैरामीटर समायोजित करने के लिए प्राप्त करने के एक सटीक पिघला बहुलक जगह है, जिसका आकार चयनित लेजर स्थान आकार से मेल खाती है. पिघला बहुलक क्षेत्र के आकार को अनुकूलित करने के लिए सेटिंग्स समायोजित. निम्न पैरामीटर एकल वर्ग चतुर्थ दा न्यूरॉन्स microdissecting के लिए इस्तेमाल किया गया: स्पॉट व्यास सुक्ष्ममापी 7.5, लेजर शक्ति 30-50 मेगावाट, लेजर समय और एमएस 2-4 और 1-2 एससेल प्रति hots इस्तेमाल किया गया. [महत्वपूर्ण कदम: लेजर एक उचित स्थान के लिए आवश्यक मापदंडों ऊतक मोटाई और कमरे में नमी शर्तों के साथ भिन्न हो सकते हैं . एकल या एकाधिक कोशिकाओं microdissecting के लिए आवश्यक पिघला बहुलक स्थान आकार को प्राप्त करने के लिए "पावर" और "अवधि" सेटिंग्स समायोजित करने के लिए.]
  9. विशिष्टता को अधिकतम करने के लिए, न्यूनतम ओवरलैप और एक मजबूत प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं microdissect. प्रत्येक टोपी कई सेल शरीर पर कब्जा करने में सक्षम है. [महत्वपूर्ण कदम: आरएनए गिरावट से बचने के के लिए, निर्जलीकरण और कम से कम 45 मिनट के लिए microdissection सहित कुल विश्लेषण समय सीमा]
  10. एक बार ब्याज की सभी कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया गया है, microdissected कोशिकाओं के साथ लिफ्ट एच एस LCM टोपी और यह एक साफ स्लाइड पर रखा करने के लिए कब्जा कर लिया कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए और नेत्रहीन अवांछित कोशिकाओं या मलबे की उपस्थिति के लिए टोपी का निरीक्षण.

4. LCM ली गई कोशिकाओं से शाही सेना अलगाव

  1. एक ExtracSure डिवाइस (आण्विक उपकरण) microdissected कोशिकाओं से युक्त टोपी संलग्न. टोपी सतह युक्त कोशिकाओं आरएनए निष्कर्षण बफर (PicoPure, आण्विक डिवाइसेज) के 12μl जोड़ें और एक औंधा प्रतिक्रिया पतली दीवारों ट्यूब ExtracSure डिवाइस कनेक्ट (GeneAmp, एप्लाइड Biosystems). एक संरेखण ट्रे (आण्विक उपकरण) पर विधानसभा प्लेस और यह एक ऊष्मायन (आण्विक उपकरण) ब्लॉक 42 पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर अंदर के साथ कवर.
  2. एक 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, 800 से पर अर्क (एक्स) छ 2 मिनट के लिए ट्यूबों युक्त अपकेंद्रित्र. ट्यूब बंद करें और -80 पर सेल के अर्क की दुकान ° C आरएनए शुद्धि के लिए तैयार है जब तक.

रोकें सूत्री

  1. निकालें और स्तंभ PicoPure (आण्विक उपकरण) शाही सेना निकासी किट निर्देशों के अनुसार शाही सेना शुद्ध. DNase उपचार वैकल्पिक है, और स्तंभ पर आवश्यक के रूप में शाही सेना शुद्धि के दौरान किया जा सकता है. यदि आवश्यक, कई LCM नमूने को अंतिम शाही सेना उपज बढ़ाने के लिए किसी एकल स्तंभ में शुद्धि के दौरान एक साथ जमा कर सकते हैं और elution बफर की एक छोटी मात्रा (11-30 μl) (PicoPure, आण्विक डिवाइसेज) में eluted किया जा सकता है है और -80 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस तक इस्तेमाल के लिए तैयार है. अगर वांछित एक μl विभाज्य 2100 Bioanalyzer (Agilent टेक्नोलॉजीज, Inc) पर कुल शाही सेना गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

प्रतिनिधि परिणाम

लेजर कब्जा microdissection (LCM) तीसरे instar लार्वा (चित्रा 1) से एकल, वर्ग विशेष या एकाधिक ड्रोसोफिला दा न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. LCM ड्रोसोफिला दा न्यूरॉन सेल शरीर (चित्र 2a ग) के अलगाव में एक सटीक और विशिष्टता के एक उच्च डिग्री के लिए अनुमति देता है . इसके अलावा, इन पृथक दा न्यूरॉन्स से शुद्ध कुल शाही सेना के लिए उत्कृष्ट गुणवत्ता के होने के रूप में तेज 5.8S, 18s और 28S ribosomal शाही सेना चोटियों की उपस्थिति ने संकेत दिया जब एक Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent टेक्नोलॉजीज, Inc) (चित्रा विश्लेषण पाया गया 2 डी).

हमारे पृथक कक्षों की neuronal विशेष संवर्धन का आकलन करने के लिए हम वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन (QRT पीसीआर) पीसीआर प्रदर्शन neuronal जीन विशिष्ट मार्कर, elav का उपयोग. QRT-पीसीआर विश्लेषण के लिए, हम LCM microdissected दा न्यूरॉन्स कि हमारे अंतर्जात नियंत्रण (rp49) और कुल शाही सेना पूरी ΔΔCt 23 विधि का उपयोग लार्वा से अलग के सापेक्ष और सामान्यीकृत इस अभिव्यक्ति में elav अभिव्यक्ति के रिश्तेदार स्तर की गणना . ये विश्लेषण elav के रिश्तेदार स्तरों में LCM में 2.5 गुना संवर्धन पर पता चला सूक्ष्म dissected दा न्यूरॉन नमूने के रूप में पूरी पशुओं (चित्रा 3) की तुलना में.

चित्रा 1
चित्रा 1: LCM ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स की. (क) आयु मिलान तीसरे instar लार्वा का चयन कर रहे हैं, धोया और (ख) अक्टूबर के साथ एक cryomold में एम्बेडेड है और -80 पर जमे हुए ° सी, (ग) 8μm धारावाहिक ऊतक वर्गों एक मानक cryostat का उपयोग कर बनाया जाता है और (घ ) पर समान रखा स्वच्छ कांच स्लाइड. चिपका ऊतक वर्गों के साथ गिलास स्लाइड -80 पर संग्रहित कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस से पहले LCM प्रसंस्करण (ई, च) तुरंत LCM पूर्ववर्ती, ऊतक वर्गों thawed और 70% इथेनॉल में संक्षेप में तय DDH ओ 2 में संक्षिप्त कुल्ला द्वारा पीछा (छ) स्लाइड्स संक्षिप्त trypsin के साथ incubated हैं और DDH 2 हे के साथ rinsed लार्वा वर्गों. लार्वा छल्ली बिना (घंटे, मैं) ऊतक वर्गों से cuticles (काला) को दूर कर रहे हैं तो आगे एक इथेनॉल ढाल में निर्जलित और xylene में अंत में मंजूरी दे दी (ञ) एक thermolabile बहुलक के साथ LCM टोपी ऊतक खंड पर रखा है और लेजर चयनित फ्लोरोसेंट सेल शरीर पर स्पंदित है. लेजर पल्स बहुलक पिघला देता है और चयनित सेल शरीर समाई. बहुलक टोपी, पर कब्जा कर लिया सेल शरीर के साथ साथ उठाया है, और (कश्मीर)

चित्रा 2
चित्रा 2: LCM दा न्यूरॉन्स के उच्च परिशुद्धता पर कब्जा की सुविधा. (क) एक निर्जलित और trypsin के प्रतिनिधि छवि 8 माइक्रोन ऊतक अनुभाग प्रदर्शन LCM से पहले इलाज किया, दो वर्ग चतुर्थ दा ppk - GAL4 द्वारा GFP के साथ लेबल न्यूरॉन्स, UASmCD8 दिखा: GFP संवाददाता तनाव. ध्यान दें, न्यूरॉन्स की (arrowhead) पकड़ने के लिए प्रकाश डाला है (ख) पर प्रकाश डाला न्यूरॉन (arrowhead) के सेल शरीर सफाई माइक्रो ऊतक अनुभाग से उच्च विशिष्टता के साथ dissected. एकल वर्ग के दृश्य (ग) पर अंत चतुर्थ - दा न्यूरॉन LCM टोपी पर कब्जा कर लिया है. (घ) Agilent कुल LCM व्युत्पन्न दा न्यूरॉन्स से अलग शाही सेना, उत्कृष्ट आरएनए गुणवत्ता दिखाने के रूप में तेज 5.8S, 18s की उपस्थिति से संकेत के 2100 Bioanalyzer electropherogram (Agilent टेक्नोलॉजीज, Inc ) और 28S rRNA चोटियों.

चित्रा 3
चित्रा 3: QRT-पीसीआर LCM में neuronal मार्कर जीन अभिव्यक्ति दा पूरे जानवर के सापेक्ष न्यूरॉन्स पर कब्जा कर लिया की पर्याप्त संवर्धन से पता चलता है न्यूरॉन LCM में विशिष्ट मार्कर जीन की अभिव्यक्ति (elav) के QRT-पीसीआर विश्लेषण दा न्यूरॉन्स (21-7-GAL4 पर कब्जा कर लिया, यूएएस mCD8: GFP) और पूरी पशुओं उम्र में मिलान तीसरे instar लार्वा तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया था. Elav LCM पर कब्जा कर लिया दा न्यूरॉन्स में अभिव्यक्ति के सापेक्ष स्तर अंतर्जात (rp49) नियंत्रण और पूरी ΔΔCt 23 विधि का उपयोग लार्वा के सापेक्ष सामान्यीकृत थे. LCM में elav के रिश्तेदार स्तर में 2.5 गुना संवर्धन पर कब्जा कर लिया दा न्यूरॉन नमूने पूरी पशुओं के सापेक्ष मनाया गया.

समस्या निवारण

समस्या: अपमानित या कम गुणवत्ता के शाही सेना.

RNase प्रयोग भर में मुक्त हालत सुनिश्चित करें. LCM पर स्लाइड प्रति 30 मिनट के लिए समय बिताया की राशि को कम करने की कोशिश करो. जब LCM प्रदर्शन के अलावा सूखी बर्फ पर स्लाइड्स और नमूने रखें. एक बार वे काट रहे हैं ऊतक वर्गों विगलन से बचें.

समस्या: अधिकांश कोशिकाओं को स्लाइड से trypsin उपचार (17-18 कदम) के दौरान खो रहे हैं.

Trypsin उपचार के समय को कम करने की कोशिश करो. Trypsin एकाग्रता को कम करने की कोशिश करो.

समस्या: छल्ली की उपस्थिति और टोपी बहुलक पर अन्य गैर विशिष्ट ऊतक मलबे.

एक चिपकने वाला 22 नोट के चिपचिपा पक्ष के साथ बहुलक सतह सोख्ता द्वारा ऊतक मलबे को हटाने का प्रयास करें.

समस्या: कम LCM दक्षता.

100% इथेनॉल और xylenes में ऊष्मायन समय बढ़ाने का प्रयास करें. कमरे नमी कम dehumidifiers का उपयोग.

Discussion

इस के साथ साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल हमारे LCM के माध्यम से ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स की अलगाव के लिए अनुकूलित विधि का वर्णन करता है. हालांकि इस LCM प्रोटोकॉल एकल, विकास की तीसरी instar लार्वा चरण से वर्ग विशेष या एकाधिक ड्रोसोफिला दा न्यूरॉन्स के विशिष्ट अलगाव के लिए डिजाइन किया गया था, प्रोटोकॉल के मामूली संशोधनों सभी विकासात्मक से आसानी से अन्य ड्रोसोफिला सेल प्रकार के कब्जा करने के लिए अनुकूलित किया जा GAL4 अलग उपयोग चरणों, यूएएस - mCD8 GFP संवाददाता transgenes जो ब्याज की कोशिका प्रकार या प्रकार का लेबल . हमारे परिणाम दिखाना है कि लेजर कब्जा सूक्ष्म dissected दा न्यूरॉन्स से प्राप्त आरएनए QRT-पीसीआर या माइक्रोएरे आधारित विश्लेषण में संभावित प्रत्यक्ष प्रयोग के लिए अनुमति देता है बहुत ही उच्च गुणवत्ता की है. इस प्रोटोकॉल के आवेदन हित के जंगली प्रकार की कोशिकाओं के कब्जा से परे का विस्तार, के रूप में यहाँ पर चर्चा की, जहां LCM हानि (यूएएस आरएनएआई) के समारोह और / या लाभ के समारोह GAL4 रोजगार अध्ययन के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है / ब्याज की एक सेल प्रकार में यूएएस प्रणाली.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम डीआरएस धन्यवाद. Yuh Nung जनवरी और LCM के साथ सहायता के लिए मक्खी इस अध्ययन में इस्तेमाल किया, स्टॉक, और वर्जीनिया Espina, डॉ. Emanuel Petricoin और डॉ. लांस Liotta प्रदान करने के लिए वेस Grueber. लेखक इस शोध का समर्थन (DNC) और जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय प्रोवोस्ट के कार्यालय (EPRI) के लिए थॉमस एफ और केट मिलर Jeffress मेमोरियल ट्रस्ट को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) MP Biomedicals PBS10X02 Diluted to 1X working solution
2.5% Trypsin Sigma-Aldrich T1426
RNase-AWAY Sigma-Aldrich 83931
Xylenes, histological grade Fisher Scientific X3S-4
RNAse-free water Fisher Scientific BP561-1
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound Tissue-Tek 4583
PicoPure RNA Isolation Kit Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions
Thin walled reaction tube with domed cap Applied Biosystems N8010611
ExtracSure Sample Extraction Device Molecular Devices LCM 0208
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps Molecular Devices LCM0505
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices Molecular Devices LCM0504
CapSure HS LCM caps Molecular Devices LCM0213
75x100 mm glass slides Fisher Scientific 12-544-3
Tissue embedding molds Fisher Scientific NC9642669
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes USA Scientific, Inc. 1415-5390
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol
Dry ice

Equipment:

  • Cryostat
  • 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
  • -80°C freezer
  • Incubator
  • PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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लेजर कैद की Microdissection<em> ड्रोसोफिला</em> परिधीय न्यूरॉन्स
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Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).More

Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).

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