Zebrafish Rheotaxis Assay: een methode voor het meten van oriëntatiegedrag in reactie op verschillende waterstroomsnelheden

Overview

Deze video beschrijft de rheotaxis-test bij zebravissen. De methode omvat het meten van oriëntatiegedrag van zebravissen als reactie op verschillende waterdebieten onder invloed van verschillende magnetische velden.

Protocol

1.Set omhoog van het Magnetische Veld met de Eendimensionale Magnetische Gebiedsmanipulatie

1. Schakel de voedingseenheid in (afbeelding 1A).
2. Plaats de opgerolde tunnel op de plaats waar het rheotactische protocol zal worden uitgevoerd (punt 3), maar houd deze los van het zwemapparaat (figuur 1A). Plaats een magnetische sonde verbonden met een Gauss/Teslameter in de tunnel en controleer welke spanning nodig is om de gekozen magnetische veldwaarde langs de hoofdas van de tunnel te verkrijgen.
   OPMERKING: Vanwege de magnetische eigenschappen van een magneet is het veld redelijk uniform in de tunnel; dit kan worden gecontroleerd door de sonde langzaam zowel horizontaal als verticaal te bewegen.
3. Koppel de sonde los en sluit de stromingstunnel aan op het zwemapparaat.
4. Begin met het rheotactische protocol (sectie 3).

2. Opstelling van het magnetisch veld met de driedimensionale magnetische veldmanipulatie

1. Schakel de CPU-, DAC- en spoelstuurprogramma's in (figuur 1B).
2. Stel het gekozen magnetisch veld in op elk van de drie assen (x, y en z).
3. Plaats de tunnel in het midden van de Helmholtz paren set.
4. Begin met het rheotactische protocol (sectie 3).

3. Test van de Zebrafish Rheotaxis in de Flow Chamber

1. Breng één tot vijf vissen over naar de stromingstunnel met behulp van een 2 L-tank met de zijkanten en de bodem verduisterd.
2. Zet de pomp aan en stel het debiet in de tunnel in op 1,7 cm/s.
   OPMERKING: Dit langzaam bewegende water houdt het water in de tunnel zuurstofrijk en vergemakkelijkt het herstel van dieren.
3. Laat de dieren 1 uur wennen aan de zwemtunnel.
4. Start de video-opname van het gedrag van de vis in de tunnel.
   OPMERKING: We gebruikten een camera (bijv. Yi 4K Action) met afstandsbediening (bijv. Bluetooth) en sloegen de video op als .mpg (30 frames/ s).
5. Start de stapsgewijze verhoging van het debiet volgens het gekozen experimentele protocol (1,3 cm/s in deze studie; Figuur 2).
   OPMERKING: Voor dit protocol gebruikten we lage debieten die voor zebravissen variëren van 0 tot 2,8 BL (lichaamslengtes)/s. Deze stroomsnelheden bevinden zich in het lagere bereik van debieten die continu georiënteerd zwemmen in zebravissen induceren (3%-15% van de kritische zwemsnelheid [U_crit]). Het gebruik van lage debieten (volgens bretts protocol) is gekoppeld aan de specifieke gedragskenmerken van deze soort in aanwezigheid van waterstromen. Zebravissen hebben de neiging om langs de hoofdas van de kamer te zwemmen, vaak te draaien, zelfs in aanwezigheid van waterstroom, en hebben de neiging om zowel stroomopwaarts als stroomafwaarts te zwemmen. Dit gedrag wordt beïnvloed door de waterstroomsnelheid, die verdwijnt bij relatief hoge snelheden (>8 BL/s), wanneer de dieren continu stroomopwaarts zwemmen (volledige positieve rheotactische respons). Verticale en transversale verplaatsingen zijn zeer zeldzaam.
6. Voer morfometrie van de dieren uit (geslacht en totale lengte [TL], vorklengte [FL], of BL) op foto's van vissen in een morfometrische kamer.
   1. Selecteer de juiste afbeelding.
   2. Open de afbeelding in Afbeelding J.
   3. Let op het geslacht van het dier (mannelijke zebravissen zijn slank en hebben de neiging geelachtig te zijn, terwijl vrouwtjes meer afgerond zijn en de neiging hebben om blauwe en witte kleuren te hebben).
   4. Klik op Analyseren > Schaal instellen en stel de schaal van de afbeelding in centimeters in, met de hele horizontale lengte van de tunnel als referentie.
   5. Klik op Analyseren > De lineaire lengte van het dier meten en vastleggen.
   6. Bereken het lichaamsgewicht (BW).
      OPMERKING: BW wordt berekend op basis van seks-FL-BW-relaties die eerder in het lab zijn gebouwd of op basis van metagegevens. De hele procedure vermijdt manipulatiestress op de dieren.

Representative Results

Figuur 1: Opstelling voor magnetische veldregeling. (A) Weergave van de zwemtunnel met een magneet voor de inductie van een statisch, horizontaal magnetisch veld in de tunnel. De magneet (0,83 omwentelingen/cm) is aangesloten op een voedingseenheid en genereert velden in het bereik van ± 250 μT (intensiteitsbereik dat het aardmagnetisch veldbereik omvat). Aan de rechterkant is een foto te zien van de magneettunnel die is aangesloten op het zwemapparaat. De tunnel is gemaakt van acryl en heeft twee geperforeerde acrylplaten geplaatst bij de waterinlaat, die garanderen dat de stroom dicht bij laminair is. (B) Diagram en foto van de drie orthogonale Helmholtz paren ingesteld voor de controle van het magnetisch veld in het geomagnetische bereik van intensiteiten. De magnetische veldsonde, de CPU, de digitaal-naar-analoog converter en de spoelstuurprogramma's die worden gebruikt om de lus te sluiten, worden ook weergegeven. Elk paar spoelen bestaat uit twee cirkelvormige spoelen met een straal (r) van 30 cm en N = 50 omwentelingen van AWG-14 koperdraden. Een drie-assen magnetometer (sensor) met selecteerbare schaal (± 88 μT tot ± 810 μT) wordt dicht bij het midden van de spoelset geplaatst. Het sensorbereik is ingesteld op waarden variërend van ±130 μT. Deze waarden werden ook gebruikt voor de metingen die in de representatieve resultaten worden beschreven (in deze omstandigheden is de nominale sensorresolutie ongeveer 0,1 μT). De intensiteit en richting van het magnetisch veld worden geregeld met een digitaal feedbacksysteem. De sensor meet de drie componenten van de magnetische veldvector (de drie assen) en de bijbehorende foutsignalen worden geëxtraheerd. Vervolgens worden de correctiesignalen gegenereerd door een eenvoudig integratorfilter. De digitale correctiesignalen worden omgezet in spanning door een digitaal-naar-analoog converter en versterkt door een geschikte spoeldriver. Deze laatste signalen worden gebruikt om de Helmholtz-paren aan te drijven. De bemonsteringsfrequentie is vastgesteld op 5 Hz en de eenheidswinstfrequentie van de lussen is ongeveer 0,16 Hz. Zodra de stromen in de Helmholtz-paren van de spoelen zijn ingesteld, varieert het totale magnetische veld minder dan 2% van de gemiddelde intensiteitswaarde in het centrale kubieke volume (met rand [L] = 10 cm) van de spoelen. Tijdens de metingen is het magnetisch veld rms minder dan 0,2 μT. In beide opstellingen (panelen A en B) wordt een statisch elektrisch veld gegenereerd door de stroom in de spoelen die het magnetisch veld produceren. De intensiteit van het elektrische veld is ongeveer 0,4 V/m wanneer de maximale stroom wordt toegepast; deze waarde is verwaarloosbaar in vergelijking met natuurlijke of kunstmatige statische velden in de omgeving waarvan de intensiteit in de orde van grootte van 1 kV/m ligt.

Figuur 2: Diagram van de debieten die tijdens de tests zijn gebruikt om de rheotactische drempel van zebravissen te bepalen. De stroming tijdens de acclimatisatieperiode van 1 uur was voldoende om een adequate zuurstoftoevoer naar de dieren te garanderen. Er kan worden aangenomen dat met dit ontwerp de zuurstoftoevoer nooit een limiet is, zelfs niet in de eerste stap van 10 minuten met stroom 0. Inderdaad, met een zuurstofgehalte van water bij 27 °C van ongeveer 7,9 mg/L en een dierlijk zuurstofverbruik van 1 mg/h.g (een overmatige benadering voor het zuurstofverbruik van zebravissen, zowel onder routineomstandigheden als bij zwemmen met lage snelheid), is het mogelijk om te berekenen dat, bij afwezigheid van stroming, de Po₂ in de flume niet meer dan 2% per dier zal afnemen, ver boven de kritische Po₂ (ongeveer 40 torr voor zebravissen).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat