Zebrafisch Rheotaxis Assay: Eine Methode zur Messung des Orientierungsverhaltens in Reaktion auf unterschiedliche Wasserdurchflussraten

Overview

Dieses Video beschreibt den Rheotaxis-Assay in Zebrafischen. Die Methode beinhaltet die Messung des Orientierungsverhaltens von Zebrafischen als Reaktion auf unterschiedliche Wasserdurchflussraten unter dem Einfluss verschiedener Magnetfelder.

Protocol

1.Einrichtung des Magnetfeldes mit der eindimensionalen Magnetfeldmanipulation

1. Schalten Sie das Netzteil ein (Abbildung 1A).
2. Platzieren Sie den gewickelten Tunnel an der Stelle, an der das rheotaktische Protokoll ausgeführt wird (Abschnitt 3), aber halten Sie ihn vom Schwimmgerät getrennt (Abbildung 1A). Platzieren Sie eine magnetische Sonde, die mit einem Gauß/Teslameter verbunden ist, in den Tunnel und überprüfen Sie, welche Spannung erforderlich ist, um den gewählten Magnetfeldwert entlang der Hauptachse des Tunnels zu erhalten.
   HINWEIS: Aufgrund der magnetischen Eigenschaften eines Magneten ist das Feld innerhalb des Tunnels einigermaßen einheitlich; Dies kann überprüft werden, indem die Sonde sowohl horizontal als auch vertikal langsam bewegt wird.
3. Trennen Sie die Sonde und verbinden Sie den Durchflusstunnel mit dem Schwimmgerät.
4. Beginnen Sie mit dem rheotaktischen Protokoll (Abschnitt 3).

2. Einrichten des Magnetfeldes mit der dreidimensionalen Magnetfeldmanipulation

1. Schalten Sie die CPU-, DAC- und Coil-Treiber ein (Abbildung 1B).
2. Legen Sie das gewählte Magnetfeld auf jeder der drei Achsen (x, y und z) fest.
3. Platzieren Sie den Tunnel in der Mitte der Helmholtz-Paare gesetzt.
4. Beginnen Sie mit dem rheotaktischen Protokoll (Abschnitt 3).

3. Test des Zebrafischs Rheotaxis in der Strömungskammer

1. Übertragen Sie ein bis fünf Fische mit einem 2-L-Tank mit den Seiten und dem Boden verdeckt in den Durchflusstunnel.
2. Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie den Durchfluss im Tunnel auf 1,7 cm/s ein.
   HINWEIS: Dieses langsam eiserne Wasser wird das Wasser im Tunnel mit Sauerstoff versorgt und die Erholung der Tiere erleichtern.
3. Lassen Sie die Tiere 1 H an den Schwimmtunnel.
4. Starten Sie die Videoaufzeichnung des Verhaltens der Fische im Tunnel.
   HINWEIS: Wir verwendeten eine Kamera (z.B. Yi 4K Action) mit Fernbedienung (z.B. Bluetooth) und speicherten das Video als .mpg (30 Frames/s).
5. Beginnen Sie die schrittweise Erhöhung der Durchflussmenge gemäß dem gewählten Versuchsprotokoll (1,3 cm/s in dieser Studie; Abbildung 2).
   HINWEIS: Für dieses Protokoll haben wir niedrige Durchflussraten verwendet, die für Zebrafische zwischen 0 und 2,8 BL (Körperlängen)/s liegen. Diese Strömungsgeschwindigkeiten liegen im unteren Bereich der Durchflussraten, die ein kontinuierliches orientiertes Schwimmen in Zebrafischen induzieren (3%–15% der kritischen Schwimmgeschwindigkeit [U_crit]). Die Verwendung niedriger Durchflussraten (nach Bretts Protokoll) ist mit den spezifischen Verhaltensmerkmalen dieser Art in Gegenwart von Wasserströmungen verbunden. Zebrafische neigen dazu, entlang der Hauptachse der Kammer zu schwimmen, sich häufig zu drehen, auch in Gegenwart von Wasserfluss, und neigen dazu, sowohl flussauf- als auch flussabwärts zu schwimmen. Dieses Verhalten wird durch die Wasserdurchflussrate beeinflusst, die mit relativ hohen Geschwindigkeiten (>8 BL/s) verschwindet, wenn die Tiere kontinuierlich flussaufwärts schwimmen (voll positive rheotaktische Reaktion). Vertikale und transversale Verschiebungen sind sehr selten.
6. Führen Sie die Morphometrie der Tiere (Geschlecht und Gesamtlänge [TL], Gabellänge [FL] oder BL) auf Bildern von Fischen in einer morphometrischen Kammer durch.
   1. Wählen Sie das entsprechende Bild aus.
   2. Öffnen Sie das Bild in ImageJ.
   3. Beachten Sie das Geschlecht des Tieres (männliche Zebrafische sind schlank und neigen dazu, gelblich zu sein, während Weibchen runder sind und dazu neigen, blaue und weiße Färbungen zu haben).
   4. Klicken Sie auf Analysieren > Skalieren festlegen, und legen Sie den Maßstab des Bildes in Zentimeter fest, indem Sie die gesamte horizontale Länge des Tunnels als Referenz verwenden.
   5. Klicken Sie auf Analysieren > Messen und zeichnen Sie die lineare Länge des Tieres auf.
   6. Berechnen Sie das Körpergewicht (BW).
      HINWEIS: BW wird aus sex-FL-BW-Beziehungen berechnet, die zuvor im Labor oder aus Metadaten erstellt wurden. Das ganze Verfahren vermeidet Manipulationsstress auf die Tiere.

Representative Results

Abbildung 1: Einrichtung für Magnetfeldsteuerung. (A) Darstellung des Schwimmtunnels mit einem Magnet für die Induktion eines statischen, horizontalen Magnetfeldes innerhalb des Tunnels. Das Magnet (0,83 Umdrehungen/cm) ist an ein Aggregat angeschlossen und erzeugt Felder im Bereich von ±250 T (Intensitätsbereich, der den Magnetischen Feldbereich der Erde umfasst). Auf der rechten Seite ist ein Foto des Magnettunnels zu sehen, der mit dem Schwimmgerät verbunden ist. Der Tunnel besteht aus Acryl und hat zwei perforierte Acrylplatten, die am Wassereinlass platziert sind, die garantieren, dass der Durchfluss in der Nähe von Laminar ist. (B) Diagramm und Foto der drei orthogonalen Helmholtz-Paare zur Steuerung des Magnetfeldes im geomagnetischen Intensitätsbereich. Die Magnetfeldsonde, die CPU, der Digital-Analog-Wandler und die Spulentreiber, mit denen die Schleife geschlossen wird, werden ebenfalls angezeigt. Jedes Spulenpaar besteht aus zwei kreisförmigen Spulen mit einem Radius (r) von 30 cm und N = 50 Umdrehungen von AWG-14 Kupferdrähten. Ein dreiachsiges Magnetometer (Sensor) mit wählbarer Skala (± 88 T bis ± 810 T) befindet sich in der Nähe der Mitte des Spulensatzes. Der Sensorbereich ist auf Werte im Bereich von ±130 T eingestellt. Diese Werte wurden auch für die in den repräsentativen Ergebnissen beschriebenen Messungen verwendet (unter diesen Bedingungen beträgt die nominale Sensorauflösung etwa 0,1 t). Die Intensität und Richtung des Magnetfeldes werden mit einem digitalen Rückmeldesystem gesteuert. Der Sensor misst die drei Komponenten des Magnetfeldvektors (die drei Achsen), und die entsprechenden Fehlersignale werden extrahiert. Anschließend werden die Korrektursignale durch einen einfachen Integratorfilter erzeugt. Die digitalen Korrektursignale werden durch einen Digital-Analog-Wandler in Spannung umgewandelt und durch einen geeigneten Spulentreiber verstärkt. Diese letzten Signale werden verwendet, um die Helmholtz-Paare anzutreiben. Die Abtastfrequenz ist auf 5 Hz festgelegt und die Einheitsverstärkungsfrequenz der Schleifen beträgt etwa 0,16 Hz. Sobald die Ströme in den Helmholtz-Paaren der Spulen eingestellt sind, variiert das gesamte Magnetfeld weniger als 2% von seinem mittleren Intensitätswert im zentralen kubischen Volumen (mit Kante [L] = 10 cm) der Spulen. Während der Messungen beträgt das Magnetfeld rms weniger als 0,2 t. In beiden Setups (Panels A und B) wird durch den Strom in den Spulen, die das Magnetfeld erzeugen, ein statisches elektrisches Feld erzeugt. Die Intensität des elektrischen Feldes beträgt etwa 0,4 V/m, wenn der maximale Strom angewendet wird; Dieser Wert ist im Vergleich zu natürlichen oder künstlichen statischen Feldern in der Umgebung, deren Intensität in der Größenordnung von 1 kV/m liegt, vernachlässigbar.

Abbildung 2: Diagramm der Fließgeschwindigkeiten, die während der Tests verwendet wurden, um die rheotaktische Schwelle von Zebrafischen zu bestimmen. Der Durchfluss während der 1 h Akklimatisierungszeit reichte aus, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung der Tiere zu gewährleisten. Es ist davon auszugehen, dass bei dieser Konstruktion die Sauerstoffversorgung nie eine Grenze ist, selbst im ersten 10-min-Schritt mit Durchfluss 0. Bei einem Sauerstoffgehalt von Wasser bei 27 °C von etwa 7,9 mg/L und einem tierischen Sauerstoffverbrauch von 1 mg/h (eine übermäßige Annäherung an den Sauerstoffverbrauch von Zebrafischen sowohl unter Routinebedingungen als auch beim Schwimmen mit niedriger Geschwindigkeit) lässt sich berechnen, dass der Po₂ im Flume ohne Durchfluss nicht mehr als 2 % pro Tier abnimmt und damit deutlich über dem kritischen Po₂ (ca. 40 Torr für Zebrafische) bleibt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution: 0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3.76024E+12	DC Double Regulated power supply
BeagleBone  Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405	Rev E Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat